一种基于j亚群禽白血病病毒ltr的线性化真核表达载体的构建方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于J亚群禽白血病病毒LTR的线性化真核表达载体的构建及应 用。此发明不仅可用于研宄ALV-J或其它反转录病毒的复制、转译、致病等机制；而且能实 现对外源基因的快速克隆、高效表达。
【背景技术】
[0002] 根据病毒囊膜蛋白抗原性、干扰中和试验以及宿主范围，禽白血病病毒（ALV)可 分为10个亚群（A-J)。与其它ALV不同，ALV-J感染主要引起造血细胞恶性增生、免疫抑制， 诱导髓细胞瘤，血管瘤等肿瘤。ALV-J前病毒基因组结构具有完整的反转录病毒基因组结 构，包括5' LTR-gag-p〇l-enV-LTR3'基本结构。其中，LTR为非编码长末端重复序列，与病 毒复制、转译密切相关；且被证明具有真核启动子和增强子活性。5'LTR不但具有RNA聚合 酶II启动子功能，还具有增强子及转录调控原件。3'LTR除了具有PolyA终止转录功能外， 也具有启动子特性。因此，有效利用LTR中序列成分，不但可以研宄ALV-J病毒复制、转译、 致病等机制，而且可构建表达载体，用于外源基因表达及运输。在传统表达载体的构建中， 往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点，通过酶切、连接的方法构建载体，实现外源基因 的表达。但有时由于找不到合适的酶切位点，往往导致克隆过程繁琐，效率低下。因此，开 发不依赖于限制性内切酶的基于ALV-J LTR的线性化真核表达载体可简化克隆过程，实现 基因快速克隆表达。
【发明内容】
[0003] 1、要解决的技术问题
[0004] 本发明的目的是在于提供一种基于J亚群禽白血病病毒LTR的线性化真核表达载 体的构建及应用方法，用于外源基因的快速克隆与表达。本发明的原理和最核心的关键技 术是科学地设计扩增出含ALV-J病毒LTR的线性化载体以及外源基因片段，利用商品化的 重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆，随后转化到大肠杆菌进 行质粒扩增与鉴定；并将阳性克隆转染真核细胞实现基因表达与运输。
[0005] 所述引物如下：
[0006] a, PCR扩增ALV-J病毒LTR线性化载体引物：
[0007] 上游引物：5 'ggttccgaacgcaatgtaacgggaggct3' ；
[0008] 下游引物：5 'gcttgatccacagggcgaccagaatca3' ；
[0009] b，PCR扩增外源基因引物：
[0010] 上游引物：5 'ccctgtggatcaagcATGNNNNNNNNNNNNNNN3' ；
[0011] 下游引物：5 'attgcgttcggaaccCTANNNNNNNNNNNNNNN3' ；
[0012] 本发明公开了 PCR扩增ALV-J病毒LTR线性化载体引物以及PCR扩增外源基因用 于体外快速重组克隆引物的保守序列。本发明还公开了一种基于ALV-J病毒LTR的外源基 因快速克隆表达的方法，其特征在于用重组酶ExnaseTM II，将线性化的ALV-J病毒LTR载 体与外源基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆转化到大肠杆菌。
[0013] 2、技术方案
[0014] 1)设计扩增含ALV-J病毒LTR的线性化载体以及外源基因片段引物：扩增含 ALV-J病毒LTR的线性化载体上游引物位于ALV-J env基因终止密码子后28个碱基；扩增 含ALV-J病毒LTR的线性化载体下游引物位于ALV-Jgag基因起始密码子前27个碱基；扩 增外源基因的上游引物中除了外源基因特异的18个碱基N外，均带有15个保守的与扩增 含ALV-J病毒LTR的线性化载体下游引物互补的碱基；扩增外源基因的下游引物中除了外 源基因特异的18个碱基N外，均带有15个保守的与扩增含ALV-J病毒LTR的线性化载体 上游引物互补的碱基。具体引物序列见附表1，由Life Technologies上海赛默飞世尔科技 公司合成。
[0015] 2)基于ALV-J病毒LTR的真核表达线性化载体的构建及应用：以含ALV-J病毒 JS-NT前病毒全基因组质粒JSNT以及外源基因为模版，利用表1中引物，PCR分别扩增出含 ALV-J病毒LTR的真核表达线性化载体ALV-LTR以及外源基因片段（附图1，步骤1);并利 用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆（附图1，步骤2);阳性克隆即可进行真核细胞转 染、表达鉴定（附图1，步骤3)
[0016] 3、有益效果
[0017] 该发明设计的引物以及构建的基于ALV-J病毒LTR的真核表达线性化载体，不仅 对研宄反转录病毒复制、转译、致病等分子机制具有重要意义；而且可实现对外源基因的快 速克隆高效表达，具有潜在的应用价值。本发明中整合了基于重组酶ExnaseTM II的快速 克隆策略。该克隆方法不依赖于限制性内切酶以及连接酶，大大简化了外源基因的克隆过 程，提高了效率。通过单轮PCR及重组即可成功获得在ALV-J病毒LTR调控下的外源基因 高效真核表达载体。
【附图说明】
[0018] 图1基于ALV-J病毒LTR的真核表达线性化载体的构建及应用策略
[0019] 步骤1 :以含ALV-J病毒JS-NT前病毒全基因组质粒JSNT以及外源基因为模版， 利用表1中引物，PCR分别扩增出含ALV-J病毒LTR的真核表达线性化载体ALV-LTR以及 外源基因片段；步骤2 :利用重组酶ExnaseTM II进行快速重组克隆；步骤3 :阳性克隆转染 真核细胞、表达鉴定。
[0020] 图2电泳分析PCR产物
[0021] 泳道1，扩增出的基于ALV-J病毒LTR的真核表达线性化载体；泳道2,扩增出的 eGFP片段。
[0022] 图3eGFP在基于ALV-J病毒LTR的真核表达载体中的表达
[0023] A，转染ALV-LTR-eGFP的DFl细胞；B，未转染的正常DFl细胞；C，转染 ALV-LTR-eGFP的293T细胞；D，未转染的正常293T细胞。
【具体实施方式】
[0024] 为更好的理解本发明的内容，以下实施方式结合附图给出了基于ALV-J病毒LTR 的真核表达线性化载体的构建及应用的示例。
[0025] 实施例
[0026] 1)设计扩增含ALV-J病毒LTR的线性化载体以及eGFP片段引物：扩增含ALV-J病 毒LTR的线性化载体上游引物位于ALV-J env基因终止密码子后28个碱基；扩增含ALV-J 病毒LTR的线性化载体下游引物位于ALV-Jgag基因起始密码子前27个碱基；扩增eGFP片 段的上游引物中除了 eGFP片段特异的18个碱基外，还带有15个保守的与扩增含ALV-J病 毒LTR的线性化载体下游引物互补的碱基；扩增eGFP片段的下游引物中除了 eGFP片段特 异的18个碱基外，还带有15个保守的与扩增含ALV-J病毒LTR的线性化载体上游引物互 补的碱基。具体引物序列见附表1，由Life Technologies上海赛默飞世尔科技公司合成。
[0027] 2)基于ALV-J病毒LTR的真核表达线性化载体以及eGFP片段PCR扩增：以含 ALV-J病毒JS-NT前病毒全基因组质粒JSNT以及pcDNA3. I-EGFP为模版，表1所述引物为 引物进行PCR扩增。如图1中的步骤1。PCR扩增反应体系为：40 μ 1水，5 μ 1 10倍缓冲液， 14110禮（1阶13，1411(^111〇1上游引物，1411(^111〇1下游引物，14110叩/^1的几阶' 以及 pcDNA3.1-EGFP，l μ 1商品化的 Phanta Super-Fidel i ty DNA 聚合酶。PCR 扩增反应 循环参数为：95°C变性3分钟，随后进行30个循环（95°C变性10秒，57°C退火30秒，72°C 延伸3分钟），最后72°C延伸10分钟。PCR结束后，PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电 泳。如图2所示，其中泳道M表示对照品DNA Marker的电泳分析图，其中泳道1、2分别代 表基于ALV-J病毒LTR的真核表达线性化载体ALV-LTR (SEQ ID NO. 7)以及eGFP片段PCR 扩增产物的电泳分析图。
[0028] 3) eGFP片段快速克隆进基于ALV-J病毒LTR的真核表达载体：将以上纯化的基于 ALV-J病毒LTR的真核表达线性化载体ALV-LTR以及eGFP片段PCR产物在商品化重组酶 ExnaseTM II的作用下进行重组克隆。如图1中的步骤2。具体重组反应体系如下：纯化的 eGFP产物50-100ng，纯化的基于ALV-J病毒LTR的真核表达线性化载体50ng，2 μ 1商品化 的ExnaseTM II酶，4 μ 1 5倍的缓冲液，其它补加水至20 μ 1。反应物于37°C作用30分钟 后，置冰上5分钟。随后将20μ1反应物转化到常规感受态细菌，涂LB板。次日挑取细菌 克隆进行质粒制备，阳性克隆鉴定。
[0029] 4)eGFP在基于ALV-J病毒LTR的真核表达载体中的表达：将获得的含EGFP的阳性 克隆（命名为ALV-J-LTR-eGFP)转染DFl或293T细胞，转染12, 24, 36hr后，在荧光显微 镜下观察EGFP的表达。如图1中的步骤3。具体转染步骤如下：取2ug的ALV-J-LTR-eGFP 质粒加入到50ul的OPTI-MEM培养基，随后与4ul的Mirus转染试剂混匀；室温放置45min 后，加入450ul的OPTI-MEM培养基混匀后，直接加到新鲜培养的贴壁的DFl或293T细胞。 转染12hr后，在荧光显微镜下观察EGFP的表达。在转染后12小时，不管是在DFl细胞还 是在293T细胞，在荧光显微镜下都能观察到大量eGFP的表达。图3A是ALV-J-LTR-eGFP 在DFl细胞中的表达，图3C是ALV-J-LTR-eGFP在293T细胞中的表达；图3B，D分别是正常 DFl以及293T细胞。
[0030] 表1线性化载体和外源基因引物设计。
[0031]
【主权项】
1. 一种基于J亚群禽白血病病毒LTR的线性化真核表达载体的制备方法，其特征在于， 利用下述引物，以JSNT毒株为模板，进行PCR扩增得ALV-J病毒LTR线性化载体； 上游引物：5 'ggttccgaacgcaatgtaacgggaggct3' ； 下游弓I物：5 <gcttgatccacagggcgaccagaatca3, 〇
2. -种利用J亚群禽白血病病毒LTR的线性化真核表达载体表达外源基因的方法，其 特征在于包括以下步骤： 1) 以含ALV-J病毒前病毒全基因组质粒JSNT为模板，以SEQIDNO. 1和2为引物，PCR 扩增出含ALV-J病毒LTR的真核表达线性化载体； 2) 以外源基因为模板，以SEQIDN0. 3和4为引物，PCR扩增出外源基因片段； 3) 并利用重组酶ExnaseTMII对步骤1)和2)得到的PCR产物进行快速重组克隆；阳 性克隆即可进行真核细胞转染、表达鉴定。
【专利摘要】本发明涉及一种基于J亚群禽白血病病毒LTR的线性化真核表达载体的构建及应用。本发明是SEQ ID NO.1和2的序列为引物，以JSNT毒株为模板，进行PCR扩增得ALV-J病毒LTR线性化载体；本发明不仅可用于研究ALV-J或其它反转录病毒的复制、转译、致病等机制；而且能实现对外源基因的快速克隆、高效表达。
【IPC分类】C12N15-867
【公开号】CN104726498
【申请号】CN201510153415
【发明人】叶建强, 范中雷, 田晓彦, 秦爱建, 邵红霞
【申请人】扬州大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月2日