普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子作为基因载体的新应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医用材料领域，涉及普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子作为基因载体的新应用。
技术背景
[0002]转基因技术是一种非常重要的分子生物学手段，而用纳米粒子来制备基因转导的载体具有很多的优势。一个良好的基因转导载体需具备以下条件:其生物安全性好，在体内可实现生物降解，毒性和免疫原性较小；基因载体的大小合适，可以高效顺利进入细胞体内传递外源基因；可以高效的结合带有负电的核酸分子，具有很好的包封效果；载体在生理条件下比较稳定，不易发生聚集而形成沉淀；转染效果较好，可以有效的实现多种细胞的稳定的基因转染。
[0003]壳聚糖是一种广泛使用的药物载体和基因载体材料，具有生物相容性好，在体内可以进行充分代谢等特点，已经广泛应用于科研和临床实践当中，是一种非常理想的基因转染材料。
[0004]普鲁士蓝是临床上应用已久的解毒药物，其生物安全性好，在体内的毒性和副作用非常低，是一种很好的药物载体。最近研究发现普鲁士蓝是一种很好的光热材料，在用808nm激光器进行照射时可以产生热量来杀死肿瘤细胞。
[0005]采用808nm激光器照射普鲁士蓝等光热材料可以产生较高的温度，但是当控制照射时间和功率时，可以将光热产生的温度控制在一定范围之内，在保证细胞较高的存活率的情况下，通过升温促进细胞表面细胞膜的通透性，从而增强本载体的转基因效果。
[0006]本发明具有很多的优势和很好的应用前景:首先，普鲁士蓝和壳聚糖都是临床上正在应用的生物材料，其生物安全性得到了很好的保证；其次，普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子具有很小的粒径和较高的正电位，可高效吸附核酸，具有很好的包封效果；再次，在转基因操作时，采用808nm波长的激光器进行定点照射，可以有效的控制照射区域的温度，从而达到在靶向区域和特定部位增强转基因效果的功能；最后，该复合纳米粒子的制备方法条件温和，操作简单，所需原料安全易得，价格低廉。
【发明内容】
[0007]本发明的目的之一是普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子作为基因载体的新应用。
[0008]本发明的目的之二是提供上述普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子在细胞实验中通过光热作用增强转染效率的使用方法，特别是用于报告基因GFP基因对于动物细胞的转染方法。
[0009]为达到以上目的，本发明的技术方案为:
[0010]普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子的制备方法是以壳聚糖为骨架，在其上原位生长普鲁士蓝晶体，经过洗涤离心即得普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子。具体过程如下:
[0011](I)将壳聚糖溶于稀盐酸中搅拌，通过0.22 μ m微孔滤膜的过滤灭菌器进行过滤后，加入铁氰化钾和氯化亚铁，搅拌后加入三倍体积的丙酮，1000g离心30分钟后用丙酮清洗干燥得到复合纳米粒子。其中所述的壳聚糖的分子量范围为2-30万，在0.5mol / L的稀盐酸中完全溶解，浓度为0.75mg / ml ;所述的DNA溶液浓度为Img / m ;所述的普鲁士蓝的制备方法为向80ml的壳聚糖溶液中先后加入20ml，ImM的铁氰化钾溶液和20ml，ImM的氯化亚铁溶液，充分搅拌后颜色逐渐变为深蓝色，证明有普鲁士蓝晶体形成。
[0012](2)上述制备得到的普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子可以应用于基因转染。具体过程如下:
[0013]将普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子在水中溶解超声，将其与核酸在培养基中按照一定比例混合，使核酸在其表面吸附，将载体-DNA溶液入培养的HeLa细胞中，孵育I小时后用808nm激光器对其照射，使其通过光热作用更好的进入细胞，然后换回新鲜培养基继续培养48小时，在荧光显微镜下观察该载体的基因转染效果。
[0014]同现有基因载体相比较，本发明所述的普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子开发为新型的基因转染载体，具有以下突出优势:
[0015]I本发明首次制备用普鲁士蓝和壳聚糖这两种生物安全性非常好的生物材料制备了普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子，并将其应用于基因转染，该方法操作简便，原料易得，价格低廉。
[0016]2本发明首次用808nm激光器对普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子进行照射，通过光热作用增强细胞膜的通透性促进了转基因效果。方法简单实用，可实现对特定区域的细胞增强转染效率，具有很好的操作性。
[0017]3与其他基因粒子相比，普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子具有生物安全性好，粒径较小易于摄取，价格较低，可以通过光照来控制局部的转染效率，转染效率高等特点。
【附图说明】
[0018]图1是本发明所述普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子的透射电子显微镜图和动态光散射图；图2为普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子在不同浓度下的紫外吸收图(a:0.015mg /ml ；b:0.031mg / ml ；c:0.0625mg/ml ；d:0.125mg / ml ；e:0.25mg/ml ；f:0.5mg / ml);图3为普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子在水中，PBS缓冲溶液和培养基中的照片:(a)水溶液(b)PBS溶液(c)细胞培养液；图4为普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子在水溶液中用808nm激光器照射后的温度曲线图；图5为普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子与核酸按不同比例混合吸附后进行电泳的图片 a,O ；b,0.1 ；c,0.2 ；d0.4 ；e,0.8 ；f, 1.6 ；g3.2 ;h，6.4 ;图 6 为普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子与核酸吸附后，用808nm激光器照射后HeLa细胞的MTT存活曲线图；图7为普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子与商品化的转基因载体聚乙烯亚胺(PEI)对HeLa细胞的毒性对比的HeLa细胞的MTT曲线图；图8为普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子在照射后的24小时，48小时以及72小时后的细胞转染的荧光显微镜图，对照为商品化的转基因载体(PEI)和空白对照组。
【具体实施方式】
[0019]通过以下【具体实施方式】将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
[0020]实施例1
[0021]低分子量壳聚糖溶于0.5mol / L稀盐酸中搅拌，使其终浓度为0.75mg/ml，通过0.22 μ微孔滤膜过滤除菌之后的，向80ml的壳聚糖溶液中先后加入20ml，ImM的铁氰化钾溶液和20ml，ImM的氯化亚铁溶液，充分搅拌，颜色逐渐变为深蓝色后其中加入三倍体积的丙酮，1000g离心30分钟后用丙酮清洗干燥得到复合纳米粒子。
[0022]实施例2
[0023]通过透射电子显微镜和动态光散射法测知粒子大小均匀稳定，其粒径大小为4nm左右(图1).测量其紫外吸收曲线，发现其在700nm处有明显的吸收峰(图2)。将普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子后溶于水，PBS缓冲液和培养基中，发现溶液均匀稳定(图3).然后将该载体用808nm激光器照射后考察其温度变化，发现其具有很好的升温效果(图4)
[0024]实施例3
[0025]将该溶液与核酸按照不同的配比在培养基溶液中混和均匀，静止20分钟后，向1%琼脂糖的凝胶中加入样品，以IlOv电泳20分钟后观察，可以发现普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子可以与核酸进行很好的结合(图5)。按照完全吸附核酸的普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子与核酸的比例来进行后续实验，将该核酸复合物与细胞混合孵育后用808nm激光照射，考察其MTT存活率与照射时间的关系(图6)，并将其与商品化的转基因载体聚乙烯亚胺(PEI)的细胞毒性进行比较，从中可以看出普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子的细胞毒性非常低(图7)。
[0026]实施例4
[0027]将普鲁士蓝壳聚糖纳米复合粒子与绿色荧光蛋白GFP基因在培养基中混合，静止20分钟左右，然后将其放入细胞培养皿中与细胞孵育I小时，然后用808nm的激光器以IW / cm2的功率对其照射1，2，4，8分钟，然后将培养基倒掉，换成新鲜的完全培养基继续培养24小时，48小时和72小时，然后用荧光显微镜进行观察，发现随孵育时间和照射时间的延长，普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子的基因转染效率也越来越高。
【主权项】
1.普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子的新应用，其特征在于:所述的普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子用于作为基因转染的载体。
2.根据权利要求1所述的普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子的新应用，其特征在于:所述的复合纳米粒子在波长为650-1300nm的近红外区域具有强吸收。
3.根据权利要求1和2所述的普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子，其特征在于:所述的壳聚糖的分子量范围为2-30万。
4.根据权利要求1，2和3所述的普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子，其特征在于:所述的纳米粒子的粒径范围在2-1000nm之间。
5.根据权利要求1所述的普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子用于基因载体的新应用，其特征在于:基因转染过程中所用激光的波长范围在650-1300nm之间。
6.根据权利要求1和2所述的普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子用于基因载体的新应用，其特征在于:所述的纳米粒子在近红外光作用下能产生热量，增加细胞对粒子的摄取，从而提高基因转染的效率。
【专利摘要】本发明公开了一种普鲁士蓝壳聚糖复合纳米粒子作为基因载体的新应用。使用该纳米材料作为基因的载体，能有效吸收近红外激光，产生热量，从而促进纳米粒子进入细胞，显著增强基因转染效果。此外，普鲁士蓝和壳聚糖均是临床药物，具有很好的体内生物安全性，所述纳米复合体制备方法简单、绿色、成本低，将其用于基因转染具有广阔的应用前景。
【IPC分类】C12N15-85
【公开号】CN104726491
【申请号】CN201310711145
【发明人】戴志飞, 李小达, 梁晓龙, 傅光磊, 井立佳, 林丽, 杨勇博, 冯珊珊
【申请人】北京大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2013年12月20日