一类自组装短肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于纳米生物学领域，具体设及一类自组装短肤及其应用。
【背景技术】
[0002] TaqDNA聚合酶的发现使PCR技术变得简捷、同时也降低了成本，PCR技术得W广 泛应用，并逐步应用于临床。但由于Taq酶在高温下的半衰期的限制，使得PCR反应时间有 所局限。而现下大部分的改造都集中于运用基因工程技术合成性能优越、更耐热的酶。但 此方法耗时长、成本高，而且凡是蛋白酶都容易在高温下失活，因此无法从根本上解决此问 题。
[0003] 自组装短肤自问世W来已有二十多年，近几年更是得到快速发展，尤其是手性自 组装短肤体系的提出使得短肤的设计思路更加广泛，现已有多种不同体系的短肤成功应 用于细胞工程、组织工程、药物控释、创伤快速修复W及稳定膜蛋白等领域（见化ongli Luo,化uguang)。在稳定蛋白质领域中，已经有报道一种类似磯脂结构的自组装短肤AeD可 W显著延长视紫红质在40°C下的半衰期（见Xiao化n化aoPNAs)。实验表明，该种类似磯 脂结构，即一头亲水，一头疏水在水中能够将蛋白质包裹住，从而很好地保护了蛋白质的结 构。
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一类自组装短肤，增加自组装短肤体系的多样化W及自组装短 肤的种类，W促进自组装短肤在分子生物学中的应用。
[0005] 本发明的技术方案为：一类自组装短肤，该自组装短肤的氨基酸序列为；XXlie lielielieXX，其中X为Arg或Lys，当X为Arg时命名为R2I4R2,当X为Lys时命名为 馬1嚴。短肤氮端己酷化。
[0006]R2I4R2的氨基酸序列如沈QIDNO;1;ArgArglielielielieArgArg。
[0007]K2I4K2的氨基酸序列如SEQIDNO;2;LysLyslielielielieLysLys。
[000引本发明在手性自组装短肤的设计原则下，采用全新理念设计两条结构相似的自组 装短肤分别命名为R2I4R2和K21瓜，摩尔质量为1136. 74g/mol和1027. 74g/mol，其氨基酸 序列分别为SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2。短肤的结构特征为拥有亲水的两端和疏水的中 屯、，并能通过分子之间非共价键相互作用，形成结构明确且稳定，并具有某些理化性质的超 分子结构或分子聚集体。
[0009] 实验表明，本发明所述自组装短肤在盐离子溶液中能自组装形成纳米支架结构， 且离子浓度的高低对其结构影响较大，在不同的离子环境下，儀离子对其结构影响较大。
[0010] 实验表明，温度的变化对本发明所述自组装短肤的结构影响不大，能够在PCR的 温度不断变化过程中维持稳定的二级结构。
[0011] 实验表明，本发明所述自组装短肤形成的支架结构能够在溶液中包裹住Taq酶， 稳定酶的空间结构，从而抵抗高温，延长其在高温下的半衰期。
[0012] 实验表明，本发明所述的自组装短肤能够稳定Taq酶的结构而不影响其功能，从 而增加PCR的扩增效率，大大增加PCR的扩增产量。因此，此种短肤可W作为蛋白质或酶的 保护材料，应用到分子生物学领域。
[0013] 实验表明，本发明所述短肤R2LR2在金属盐离子、细胞培养基等环境下，能进行自 组装形成纳米纤维。
[0014] 实验表明，本发明所述自组装短肤R2I化形成的纳米纤维，细胞能在其上进行立维 黏附、生长，所W，此自组装短肤可用与动物细胞和植物细胞=维培养中。
[0015] 本发明具有W下有益效果：
[0016] 1、提供了 一类新型自组装短肤，增加自组装短肤类型。
[0017] 2、提供了一类新型的自组装材料，该些材料能够形成稳定的纳米纤维，该纳米纤 维能够应用于细胞=维培养，模拟体内细胞生存的微环境，黏附细胞生长因子，提供细胞体 外生存=维微环境。
[0018] 3、提供了一类新型的自组装材料，该类材料能够稳定Taq酶的结构，提高PCR的扩 增效率，为分子生物学领域提供一种新的研究工具。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明所述类磯脂结构的自组装短肤R2I4R2和K2I瓜的分子结构示意图 (从N端到C端）。
[0020] 图2是本发明所述类磯脂结构的自组装短肤R2I化和K2I4K2高效液相她LC)色谱 图，
[002^ 图3是本发明所述类磯脂结构的自组装短肤R2I4R2和K2I4K2的质谱（M巧图。
[00巧图4是本发明所述类磯脂结构的自组装短肤R2I化和K2I4K2圆二色谱图仰）。图 中A和B显示两条短肤在195nm处有一强负峰，而在216处有一弱的负峰，峰形完好。
[002引图5是本发明所述类自组装短肤R2I4R2和K2I4K2的原子力显微图（AFM),图中，C表示自组装短肤R2I4R2自组装2化后形成短的，交错的纳米纤维；D表示自组装短肤K2I4K2 自组装2化后形成的纳米支架结构。
[0024] 图6是本发明所述类磯脂结构的自组装短肤R2I化和K21嚴的刚果红染 色图片，图中，A是R2I化在化，2h，化，她，2化，4她的刚果红染色图巧是K2I4K2在 化，2h，化，她，2化，4她的刚果红染色图。
[0025] 图7则是用紫外可见光谱扣V)检测本发明所述类磯脂结构的自组装短肤R2LR2和 K2I4K2延长Taq酶在高温下半衰期的过程图。A是Taq酶在PCR体系缓冲液中的变化图；B 和C则是分别加入R2I4R2和K2I4K2后的Taq酶含量变化图。
[0026] 图8则是Taq酶在高温时，在不同保护材料中的半衰期变化图。
[0027] 图9是用qPCR验证本发明所述类磯脂结构的自组装短肤R2I4R2和K2I瓜能通过延 长Taq酶半衰期来提高PCR的扩增效率。A和B是自组装短肤R2I4R2分别在Taq酶浓度为 2. 5U/ul和抓All时自组装前（Oh)和自组装后（2化）对PCR结果的影响；C和D是自组装 短肤K2I4K2分别在Taq酶浓度为2.抓All和抓All时自组装前（Oh)和自组装后（2化）对 PCR结果的影响。
[002引图10是本发明所述类磯脂结构的自组装短肤R2LR2和K2I4K2加入PCR反应体系后 反应产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0029] 图11是本发明所述自组装短肤R2I化用于烟草细胞的^维培养图（100X)，培养 时间为7天。图最后一排为高倍镜（400X)下烟草细胞的分裂相。
[0030] 图12是本发明所述自组装短肤R2I4R2用于烟草细胞的立维培养的町晚澄/漠化 己锭（AO/EB)染色图（40X物镜）。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1 ;类脂状结构的自组装短肤R2I化和K 21瓜的制备
[0032] 1、材料
[003引 FmocA-Arg(pbf)-OH(9-巧甲氧幾酷基精氨酸-丫-叔了氧幾酷基）、 Fmoc-Arg(pbf)-WangResin(9-巧甲氧幾酷基精氨酸-丫-叔了氧幾酷基-王树 脂）、FmocA-Ile炬oc)-0H巧-巧甲氧幾酷基-k异亮氨酸-e-叔了氧幾酷基）， FmocA-LyS炬OC) -0H(9-巧甲氧幾酷基赖氨酸-e-叔了氧幾酷基）、TBTU(0-苯并S氮 挫-N，N，N'，N' -四甲基脈四氣棚酸醋）、皿TU(0-苯并S挫-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六 氣磯酸脂）和H0BT(1-哲基苯并S氮挫）、嗽晚、六氨化晚、醋酸酢、二氯甲烧；溶剂；DMF(N、 N-二甲基甲酯胺）、TFA(S氣己酸）、ACN(己膳）、冰己離。
[0034] 2、合成方法
[003引采用Fmoc (巧甲氧幾基）保护的固相合成法，具体步骤如下：
[0036] (1)第一个Arg的准备；称 0. 7mmol/g的Fmoc-Arg(pbf)-Wan浊esin30g，用 300ml 20%六氨化晚溶液脱FmoclOmin。抽滤后再用200mlDMF洗漆2次，每次时间2分钟，甲醇 洗漆1次，二氯甲烧洗漆一次，再用200mlDMF洗漆2次，每次2分钟，洗完后取少量树脂做 巧S酬检，结果呈阳性。然后向反应器中加入原料：
[0037]
【主权项】
1. 一类自组装短肽，其特征在于，该自组装短肽的氨基酸序列为：XXlielielielie XX，其中X为Arg或Lys，当X为Arg时命名为R2I4R2，当X为Lys时命名为K2I4K2，短肽氮端 乙酰化。
2. 根据权利要求1所述的一类自组装短肽在稳定Taq酶中的应用。
3. 根据权利要求1所述的一类自组装短肽在增加PCR的扩增效率中的应用。
4. 根据权利要求1所述的一类自组装短肽中的R2I4R2在动物细胞和植物细胞三维培养 中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一类自组装短肽及其应用，该自组装短肽的氨基酸序列为：XX Ile Ile Ile Ile XX，其中X为Arg或Lys，当X为Arg时命名为R2I4R2，当X为Lys时命名为K2I4K2。本发明提供了一类新型自组装短肽，增加自组装短肽类型。提供了一类新型的自组装材料，这些材料能够形成稳定的纳米纤维，该纳米纤维能够应用于细胞三维培养，模拟体内细胞生存的微环境，黏附细胞生长因子，提供细胞体外生存三维微环境。提供了一类新型的自组装材料，该类材料能够稳定Taq酶的结构，提高PCR的扩增效率，为分子生物学领域提供一种新的研究工具。
【IPC分类】C12N9-96, C12N5-04, C12N15-10, C07K7-06
【公开号】CN104725475
【申请号】CN201510134719
【发明人】罗忠礼, 李萌萌, 于华婧, 刘运成, 陈振银, 徐晓帆, 李心远, 谭卯, 谭焜月, 张姗姗, 张宇
【申请人】罗忠礼
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月26日