高致病性猪蓝耳病病毒的检测引物、探针及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种高致病性猪蓝耳病病毒 (HP-PRRSV)的检测引物、探针及检测方法。
【背景技术】
[0002] 猪蓝耳病病毒（PRRSV)是单链RNA病毒，基因组全长15kb，属于动脉炎病毒科动 脉炎病毒属。猪蓝耳病又称"猪繁殖与呼吸综合症"，该病毒可引起成年猪繁殖障碍、流产 和死胎，以及仔猪呼吸异常，是一种高度传染性疾病。1987年猪蓝耳病首次在北美发现，现 已席卷全球，成为危害性最大的猪传染性疾病之一。猪蓝耳病病毒可以分为两种基因型， 即以VR-2332株为代表的美洲型毒株和以Lelystadvirus(LV)代表的欧洲型毒株。高致 病性猪蓝耳病是由高致病性猪蓝耳病病毒（HighlyPathogenicPorcineReproductive andRespiratorySyndromeVirus,HP-PRRSV)引起的一种急性高致死性传染病，于2006年 在中国首次发现；发现的当年在中国感染了 200万头猪，死亡率达到20%。序列分析表明， HP-PRRSV在非结构蛋白2 (NSP2)编码区内存在一段不连续的30个氨基酸的缺失。
[0003]目前，检测猪蓝耳病病毒的方法包括病毒的分离和培养，酶联免疫吸附（ELISA) 等，但这些方法在灵敏性和特异性方面仍存在一定不足。反转录PCR(RT-PCR)技术由于灵 敏性和特异性较高，已经成为猪蓝耳病检测的常用方法。但常规RT-PCR需要进行后续电 泳鉴定，易发生交叉污染而产生假阳性，且操作耗时较长。相比之下，荧光定量PCR技术 (real-timeRT-PCR)具有更高的灵敏性，且无需PCR后续处理，能有效避免交叉污染并提高 检测效率。
[0004] 然而，目前基于RT-PCR检测蓝耳病的方法都要进行病毒RNA提取，然后以RNA为 模板进行检测；这一RNA提取步骤无疑大大增加了检测工作量、时间和成本，难以实现高通 量检测；此外，提取RNA的过程仍容易发生RNA降解或交叉污染等事件；且对于痕量样本， 提取RNA仍存在较大困难。
[0005] 因此，现有的基于RT-PCR检测蓝耳病的方法还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0006] 基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的高致病性猪蓝耳 病病毒的检测方法，以及该检测方法所使用的引物和探针。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
[0008] 一种高致病性猪蓝耳病病毒的检测引物，所述检测引物如SEQIDNo:1和SEQID No:2所示。
[0009] 一种高致病性猪蓝耳病病毒的检测探针，所述检测探针如SEQIDNo:3所示。 [0010] 一种高致病性猪蓝耳病病毒的检测方法，使用上述检测引物和检测探针进行检 测，包括以下步骤：
[0011] 将血清样本直接加至荧光定量RT-PCR反应体系中，进行荧光定量RT-PCR，反应结 束后检测PCR产物中是否含有高致病性猪蓝耳病病毒；其中，
[0012] 所述荧光定量RT-PCR反应体系为：
【主权项】
1. 一种高致病性猪蓝耳病病毒的检测引物，其特征在于，所述检测引物如SEQ ID No: I 和SEQ ID No:2所示。
2. -种高致病性猪蓝耳病病毒的检测探针，其特征在于，所述检测探针如SEQ ID No:3 所示。
3. -种高致病性猪蓝耳病病毒的检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的检测 引物和权利要求2所述的检测探针，包括以下步骤： 将血清样本直接加至荧光定量RT-PCR反应体系中，进行荧光定量RT-PCR，反应结束后 检测PCR产物中是否含有高致病性猪蓝耳病病毒；其中， 所述荧光定量RT-PCR反应体系为：
所述荧光定量RT-PCR的反应程序为：55土TC反应30min，95 °C反应5min; 94°C变性30s，60±1°C退火/延伸40s，反应35~45个循环。
4.根据权利要求3所述的高致病性猪蓝耳病病毒的检测方法，其特征在于，所述荧光 定量RT-PCR反应体系为：
5.根据权利要求3所述的高致病性猪蓝耳病病毒的检测方法，其特征在于，所述荧光 定量RT-PCR的反应程序为：55°C反应30min，95°C反应5min;94°C变性30s，60°C退火/延 伸40s，反应40个循环。
【专利摘要】本发明公开了一种高致病性猪蓝耳病病毒的检测引物、探针及检测方法，是将血清样本直接加至包括检测引物和探针的荧光定量RT-PCR反应体系中，进行RT-PCR，结束后检测是否含有高致病性猪蓝耳病病毒。本发明方法实现了在一个PCR管中连续、自动进行病毒RNA的释放、反转录和荧光定量PCR检测；从得到病毒血清样本到获得检测结果只需要1.5个小时；灵敏性、准确性可与传统RT-PCR相媲美；克服了传统RT-PCR需要提取RNA这一繁琐步骤的不足，减少操作步骤，提高检测速度，节省成本，有效避免交叉污染，能进行高致病性猪蓝耳病病毒的高通量检测，对快速发现高致病性猪蓝耳病疫情，及时制定防控措施具有重要的意义。
【IPC分类】C12Q1-70, C12N15-11, C12Q1-68, C12R1-93
【公开号】CN104711369
【申请号】CN201310684967
【发明人】苟德明, 张利, 康康
【申请人】苟德明, 张利, 康康
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2013年12月13日