Cyp2c19*2基因型快速检测试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种CYP2C19*2基因型快速检测试剂盒及 其检测方法。
【背景技术】
[0002] 单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphism,SNP)主要是指在基因组水 平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。在基因组DNA中，任何碱基均有可能 发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总体来 说，位于编码区内的SNP(codingSNP，cSNP)比较少，但它在遗传性疾病研究中却具有重要 意义，因此cSNP的研究更受关注。
[0003] 从对生物的遗传性状的影响上来看，cSNP可分为2种：一种是同义cSNP，S卩SNP所 致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的 含义相同；另一种是非同义cSNP，指碱基序列的改变可使以其为模板翻译的蛋白质序列发 生改变，从而影响蛋白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。
[0004]SNP与许多疾病相关，决定了人类疾病的易感性和药物反应的差异性。因此，SNP 在分析诊断、临床检验、法医学、病原检测、遗传疾病和新药研发等方面具有重要的应用价 值。
[0005] 分子信标（molecularbeacon)是一种在5'和3'末端自身形成一个8个碱基左 右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的 荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。在这种结构下，荧光基团被激发后产生的 光子被淬灭剂淬灭，所以不会产生荧光。在高温变性或之后的退火杂交过程中，这种结构被 破坏，导致荧光基团远离淬灭基团，荧光便能被激发并被监测仪器探测到。
[0006]CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中的重要成员，在肝脏中大量表达，参与多种药 物的代谢。由于CYP2C19基因具有单核苷酸多态性，因此CYP2C19酶活性存在显著的个体差 异和种族差异。其最常见的两种突变是CYP2C19*2和CYP2C19*3,它们都属与非同义突变， 所以能直接影响该酶对药物的代谢能力。CYP2C19*2 (681G>A，rs244285)变异，导致翻译过 程中产生一个异常的剪接位点从而产生一个截短的无功能的蛋白质。在药物代谢过程中， 该突变会使一些药物的血药浓度升高，如抗凝血药物氯吡格雷、抗抗癫痫药物苯妥英钠等， 使患者出现不良的药物反应。
[0007]CYP2C19*2突变基因型有纯合子A/A和杂合子G/A两种，其野生型基因型为G/G。 纯合子A/A患者对药物的代谢类型属于慢代谢型，杂合子G/A患者对药物的代谢类型属于 中等代谢型，而野生型G/G患者对药物的代谢属于正常代谢型。通过确定患者的基因型，就 可以判定患者的药物代谢类型，从而帮助医生正确选择合适的药物并合理调整药物剂量， 提高药物使用有效性，降低毒副作用。
[0008] 目前，用于临床检测CYP2C19*2基因型的试剂盒大多使用探针法，测定DNA来确定 CYP2C19*2的代谢类型，从而为诊断疾病做出依据，而现有的探针法均需要使用提取纯化的 DNA作为模板。而提取纯化的DNA，增加了抽取血液和提取血液DNA的步骤。从抽血到提取 纯化DNA至少需要4个小时。并且目前市面上的试剂在使用时操作者需要根据试剂盒中的 试剂组分和说明配制试剂然后才能使用，此过程容易造成试剂的污染，并增加了检测操作 步骤，延长了检测时间，从抽血提取DNA到得出检测结果的整个过程至少需要8小时。因此， 难以满足临床疾病的快速诊断，增加了患者疾病治疗的风险。
【发明内容】
[0009] 本发明要解决的技术问题是提供一种能快速检测CYP2C19*2基因型，减小患者疾 病治疗风险的CYP2C19*2基因型快速检测试剂盒及其检测方法。
[0010] 为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：CYP2C19*2基因型快速检测 试剂盒，包括PCR反应混合液，PCR反应混合液原料包括DNA聚合酶、dNTPs、CYP2C19*2上 游引物、CYP2C19*2下游引物、CYP2C19*2突变型分子信标、CYP2C19*2野生型分子信标、 MgC12、PCR缓冲液和细胞裂解液。
[0011] 采用本发明技术方案的CYP2C19*2基因型快速检测试剂盒，PCR缓冲液的作用是 有助于酶的稳定，给聚合酶提供一个最适合酶催化反应条件；
[0012] dNTP是deoxy-ribonucleosidetriphosphate(脱氧核糖核苷三憐酸）的缩写， dNTPs则是由四种脱氧核苷酸（dATP、dGTP、dTTP、dCTP)以相同的比例混合而成，是DNA复 制的原料；
[0013]MgCl2的作用是提供Mg2+与dNTP以及DNA模板结合形成复合体，只有这种复合体 才能被DNA聚合酶识别；
[0014]DNA聚合酶为GoTaqDNAPolymerase,以DNA为复制模板，从DNA由5'端点开始 复制到3'端的酶。
[0015]CYP2C19*2上游引物、CYP2C19*2下游引物作为DNA复制的起始点，因为在DNA合 成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上，因此，在核酸合成反应时，弓丨 物作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用。
[0016] 细胞裂解液的作用是溶解细胞质和细胞膜，破坏分子间许多微弱的化学键，分解 一些蛋白酶，降低细胞裂解之后产生的杂质对PCR反应的影响。因此，由于上述PCR反应 混合液中含有细胞裂解液，所以加入口腔细胞作为模板就可实现对CYP2C19*2基因型的检 测。上游引物和下游引物是在CYP2C19*2基因检测位点两端设计的特异性引物，突变型分 子信标特意地与CYP2C19*2突变序列结合，而野生型分子信标与正常的CYP2C19*2基因特 异结合。
[0017] 本发明的检测原理为：在CYP2C19*2基因突变位点两侧保守区域设计一对引物， 并在突变位点序列处设计两个分子信标，CYP2C19*2突变型分子信标、CYP2C19*2野生型分 子信标，CYP2C19*2野生型分子信标与未突变序列结合，CYP2C19*2突变型分子信标与突 变位点序列结合。野生型分子信标5'端用6-FAM荧光素标记，而突变型分子信标5'端用 AlexaFluor594或CalFluorRed610突光素标记，或者野生型分子信标5'端用Alexa Fluor594或CalFluorRed610荧光素标记，而突变型分子信标5'端用6-FAM荧光素标 记，6-FAM标记的分子信标的3'端用BHQ1淬灭基团标记，而AlexaFluor594或CalFluor Red610标记的分子信标3'端都用BHQ2淬灭基团标记。在PCR退火阶段，野生型分子信 标与未突变的序列结合，而突变型分子信标与有突变位点的序列结合，在结合后，荧光基团 远离淬灭基团，此时发出的荧光被实时荧光定量检测仪记录下来，从而通过荧光的颜色来 判断所检测基因的基因型；试剂盒中的PCR反应混合物中包括有细胞裂解液，通常，PCR反 应都是以细胞中提取纯化的DNA作为模板，如果直接加入细胞提供模板，则在PCR过程中细 胞裂解不彻底，并且细胞裂解之后的细胞碎片以及一些蛋白酶会对PCR反应造成阻碍，容 易造成实验失败。而发明人在通过多次试验，把细胞裂解液的成分以一定的比例混合加在 PCR反应混合液中，实现了直接以口腔细胞为模板进行PCR反应，从而可在PCR反应的过程 中省略提纯DNA的步骤，且避免污染样品，从而节约时间。细胞裂解液的作用是溶解细胞质 和细胞膜，破坏分子间许多微弱的化学键，分解一些蛋白酶，降低细胞裂解之后产生的杂质 对PCR反应的影响，因此，在检测时，可直接取得口腔细胞作为模板进行检测，细胞裂解液 将口腔细胞的细胞膜和细胞质溶解后，分解蛋白酶并破坏化学键，得到所需DNA，这个过程 仅需要l-2h，可快速检测出结果进行分析，进而为临床的快速诊断带来依据，减小患者疾病 治疗风险。
[0018] 进一步，所述的细胞裂解液的原料由十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚组成。 聚乙二醇辛基苯基醚是一种非离子型表面活性剂，十二烷基硫酸钠是一种能够使蛋白质变 性的强阴离子去污剂。在细胞和分子生物学领域，十二烷基硫酸钠，简称SDS，经常被用于 核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸与蛋白复合物，在较高温度下，破坏蛋白质与DNA 的结合，使DNA释放出来。聚乙二醇辛基苯基醚简称TritonX-100,被用于分解蛋白酶，聚 乙二醇辛基苯基醚在基因工程中还用作限制性内切酶的缓冲液的成分之一，实验过程中， 发明人发现通过SDS和TritonX-100混合组成，可快速解决污染样品的问题。
[0019]进一步，所述的PCR缓冲液为 5xColorlessReactionBuffer。5x ColorlessReactionBuffer称为5x无色反应缓冲液。
[0020] 进一步，所述的PCR反应混合液原料的终浓度为：
[0021] DNA聚合酶 0? 04-0.lU/uldNTPs0.l-〇. 5mM
[0022] CYP2C19*2 上游引物 0? 2-0. 5uM
[0023]CYP2C19*2 下游引物 0? 2-0. 5uM
[0024]CYP2C19*2 突变型分子信标 0? 2-0. 5uM
[0025]CYP2C19*2 野生型分子信标 0? 2-0. 5uM
[0026] 5xColorlessReactionBuffer0?5-1. 5x
[0027]MgCl2 1-2. 5mM
[0028] 细胞裂解液的原料终浓度为：
[0029]十二烷基硫酸钠 0.0005-0. 015 %w/v
[0030] 聚乙二醇辛基苯基醚0.001-0. 03%w/v。
[0031] 由实验可知PCR反应混合液的原料为上述范围时，均可完成检测，且检测结果准 确。