一种饲料类芽孢杆菌及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种饲料类芽孢杆菌，同时还涉及该饲 料类芽孢杆菌在防治漂浮育苗苗期烟草白粉病方面的用途。
[0002]
【背景技术】
[0003] 烟草白粉病（tobaccowhitepowder)是烟草生产上危害性很强的病害，致病菌为 cicAoracea/??DC，其寄主范围广和危害性强，属气传真菌性病害，该病害在漂 浮育苗至烤烟整个生育期都有发生。它在中国以华南、西南和华中烟区最为普遍，发病株率 可达100%，发病叶率一般在10%~20%，严重的可达80%以上，给烟农造成严重经济损失。在 集约化漂浮育苗的情况下，病菌很快扩散，严重威胁着烟苗的生产，因此对苗期烟草白粉病 的防治迫在眉睫。
[0004] 长期以来，生产上主要靠化学防治药剂来防治烟草白粉病。20世纪80年代以来， 在我国以多菌灵为代表的苯并咪唑类杀菌剂被用于白粉病的防治，经过30多年的应用，许 多病原菌对这类药剂已经产生了严重的抗性。随后，以三唑酮、苯醚甲环唑为代表的三唑类 杀菌剂取代了多菌灵的主导地位；然而，三唑类杀菌剂由于对作物安全性的问题而使其应 用受到限制。以甲氧基丙烯酸酯类为代表的第三代化学杀菌剂目前仍未在我国烟草上进行 登记，还未用于烟草白粉病的防治。由于烟草白粉病菌具有繁殖速率高、遗传变异大和适 合度高的特性，化学药剂对它的防治越来越困难。微生物菌剂可以与病原菌竞争营养、空 间位点，诱导植物产生抗病性，其次生代谢产物对病原菌具有抑制作用、对植物具有促生作 用，且绿色、环保、安全，在植物病害的防治中具有重要的应用价值。因此，寻找环境友好的、 高效、安全的微生物菌剂，将其用于漂浮育苗苗期烟草白粉病的防治具有广阔的发展空间， 同时也是农业安全可持续发展的需要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服上述问题而提供的一种对烟草白粉病具有较好的防治效 果，且有较好的预防作用，环境友好的饲料类芽孢杆菌。
[0006] 本发明的另一目的在于提供该饲料类芽孢杆菌在防治漂浮育苗苗期烟草白粉病 方面的用途。
[0007] -种饲料类芽孢杆菌/7a/wJ7)BJF-18,其形态特征：在NA培养基 上培养24小时后产生单菌落，菌落为圆形，浅黄色，粘稠，不透明，表面突起，边缘整齐，菌 体为短直杆状，革兰氏阳性菌，可产生芽孢，可分泌蛋白酶、纤维素酶等。
[0008] 该菌种已于2013年11月1日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉 武汉大学)，保藏号：CCTCCM2013525,名称为：饲料类芽孢杆菌 BJF-18 〇
[0009] (一）饲料类芽孢杆菌BJF-18的分离步骤： 采用"稀释分离法"称取log烟草根围土壤于洁净烧杯中，加于90ml无菌水，磁力搅拌 使其充分混匀，静置20分钟后吸取0. 5ml上清液于15X150mm洁净试管中，添加4. 5ml 无菌水充分混匀得KT1浓度母液，再从稀释后的试管中吸取0.5ml上清液，再加入4. 5ml 无菌水充分混匀制得1〇_2浓度溶液，依次稀释至10 _9不同浓度的土壤溶液待用。分别吸取 上述不同浓度土壤溶液100y1，均匀涂布于培养细菌的NA平板上，28°C黑暗培养，待细菌 长出后挑取单菌落纯化。
[0010] (二）培养基： 牛肉膏蛋白胨固体培养基（NA):牛肉膏3g，蛋白胨10g，琼脂粉16g，水1000ml，pH6. 8 ~7. 2〇
[0011] 牛肉膏蛋白胨液体培养基（NB):牛肉膏3g，蛋白胨10g，水1000ml，pH6. 8~7. 2。
[0012] (三）菌种的保种和传代： 用18X180mm的试管，盛NA培养基9ml，做成斜面，接种细菌，28°C培养2-3天，置4°C保存，3个月转种一次。
[0013] 将纯化后的细菌在NA培养基上划线培养，待细菌长出后挑出单菌落，用灭菌的牙 签将细菌单菌落挑至装有5mlNB培养基的试管（15X150mm)里摇培24h，吸取700y1菌液 至2ml菌株保存管中，再向保存管中添加700y1 30%灭菌甘油，置于-20°C冰柜中长期保 存。
[0014] (四）菌种的性态特征： 该菌形成的菌落在NA平板上，30°C，培养2d，菌落直径5~10mm，菌落为圆形，浅黄 色，粘稠，不透明，表面突起，边缘整齐，菌体为短直杆状，革兰氏阳性菌。经细菌鉴定手册 描述，结合Biolog鉴定结果及16SrDNA序列分析结果，将这一菌株记为饲料类芽孢杆菌 iPaenibacillus pabulf^y^-Vd。
[0015] (五）菌种的培养特性 培养温度20 ~ 50°C，最适温度范围30 ~ 37°C;培养初始pH4. 0 ~ 9.0,最适6. 0 ~7. 0; 培养盐浓度0.5 ~ 5%，最佳0.5%;可培养碳源有葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、 纤维二塘、淀粉，其中葡萄糖最佳；可培养氮源有牛肉膏、蛋白胨、KN03、NH4N03、（NH4)2S0# NaN02，其中牛肉膏和蛋白胨最佳。
[0016] 本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明经温 室漂浮育苗防治实验表明：该菌剂能够显著降低由病原菌烟草白粉病菌引起的烟草白粉病 的发生，并具有较好的预防作用。具有同化学杀菌剂多菌灵相当的防治效果。该菌剂用湿菌 与菌种保藏液配制而成，菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液、及0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂。该菌剂可以直接喷雾漂浮育苗苗床上的烟苗。本发明是专门针对 漂浮育苗苗期烟草白粉病开发的生防菌剂。由于是微生物菌剂，对环境友好，完全没有因化 学农药的使用所带来的一系列问题，有利于无公害生产、有机生产。
【具体实施方式】
[0017] 从烤烟（Ai'cofiafla(aAacwfl?L.)根际土壤中分离得到。饲料类芽孢杆菌BJF-18 在NA培养基上培养24小时后产生单菌落，菌落为圆形，浅黄色，粘稠，不透明，表面突起， 边缘整齐，菌体为短直杆状，革兰氏阳性菌，可产生芽孢，可分泌蛋白酶、纤维素酶等。
[0018] 将上述防治烟草白粉病的菌株BJF-18在NB培养液30°C180rpm振荡培养36-48 小时，然后6000rpm离心10分钟，取BJF-18湿菌体与菌体保藏液，按质量体积比为1:50配 成菌剂，菌剂成品活菌浓度为1XX1012CFU/ml，菌体保藏液为0. 01mol/L磷酸盐缓 冲液，还含有浓度为0. 001m〇l/L的Tween40非离子型表面活性剂，所用NB培养液配制方 法为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去离子水至1L，pH6. 8~7. 2,经120°C灭菌20分钟后分 装、待用。
[0019] 饲料类芽孢杆菌BJF-18菌剂对漂浮育苗烟苗白粉病的 防效试验 病原菌孢子悬浮液的制备：采集烟草白粉病标样，选取单个病斑用毛刷将分生孢子刷 入4°C冷水中，转接于离体无病烟草叶片正面。在培养皿中垫4层湿滤纸，于25°C，12h光 照（10000LUX)，12h黑暗交替条件下培养，每隔9d在新鲜离体烟草叶片正面进行转代培养 1次。为了得到大量新鲜分生孢子供活体接种使用，分生孢子悬浮液通过喷雾器均匀地喷雾 在烟草叶片正面，培养9d后，叶片正面产生密集、菌龄基本一致的烟草白粉病菌分生孢子。 用无菌水将叶片上的白粉病菌洗下得到分生孢子悬浮液。用血球计数板测定孢子悬浮液的 浓度，并将孢子悬浮液浓度调至1〇 5个孢子/ml，备用。
[0020] BJF-18菌剂的制备：将上述防治烟草白粉病的菌株BJF-18在NB培养液 30°C180rpm振荡培养36-48小时，然后6000rpm离心10分钟，取BJF-18湿菌体与菌体保 藏液，按质量体积比为1:50配成菌剂，菌剂成品活菌浓度为1XX1012CFU/ml，菌体保 藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液，还含有浓度为0.001m〇l/L的Tween40非离子型表面活 性剂，所用NB培养液配制方法为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去离子水至1L，pH6. 8~7. 2， 经120°C灭菌20分钟后分装、待用。
[0021] 在烤烟漂浮育苗盘中育苗（品种：红花大金元)，待烟苗长至5-6叶时备用。生防菌 处理组I，将上述生防菌液均匀喷雾至烟苗叶片表面，直至流失；对照组喷雾无菌水II;多 菌灵处理组III，80%多菌灵可湿性粉剂1000倍稀释喷雾，直至流失；苯醚甲环唑处理组IV， 10%苯醚甲环唑悬浮剂2000倍液喷雾，直至流失。处理24小时后，将上述烟草白粉病菌 孢子悬浮液均匀喷雾至叶片表面，每处理处理烟苗60株。接菌后将烟苗置于自然光照下， 15-27°C，RH>80%培养。24天后观察记录叶片发病情况，并调查病情指数，计算防效。
[0022] 按照以下的病情统计分级，根据叶片发病面积进行病情统计： 0级：全叶无病； 1级：病斑面积占叶片面积的5%以下； 3级：病斑面积占叶片面积的6%~10% ; 5级：病斑面积占叶片面积的11%~20% ; 7级：病斑面积占叶片面积的21%~40% ; 9级：病斑面积占叶片面积的41%以上。
【主权项】
1. 一种饲料类芽孢杆菌BJF-18,其特征在于所述菌种的保藏号为CCTCCM2013525。
2. 如权利要求1所述的饲料类芽孢杆菌BJF-18在防治漂浮育苗苗期烟草白粉病方面 的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种饲料类芽孢杆菌及其用途，其形态特征：饲料类芽孢杆菌BJF-18 (Paenibacillus pabuli)在NA培养基上培养24 小时后产生单菌落，菌落为圆形，浅黄色，粘稠，不透明，表面突起，边缘整齐，菌体为短直杆状，革兰氏阳性菌，可产生芽孢，可分泌蛋白酶、纤维素酶等。本发明对烤烟苗期烟草白粉病具有较好的防治效果，且有较好的预防作用，环境友好。CCTCC M 201352520131101
【IPC分类】A01N63-00, C12R1-01, A01P3-00, C12N1-20
【公开号】CN104711206
【申请号】CN201410473893
【发明人】汪汉成, 王茂胜, 陈兴江, 夏海乾, 陆宁, 商胜华
【申请人】贵州省烟草科学研究院
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2014年9月17日