一种南江黄羊GSK-3β基因编码区全序列的克隆方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物基因工程技术领域，更具体地说涉及一种从南江黄羊肝脏组织中克隆GSK_3i3 ( Glycogen synthase kinase-3 beta)基因编码区全序列的方法。
【背景技术】
[0002]糖原合成酶激酶-3 (GSK-3)是一种通过自身磷酸化与去磷酸化起到调控作用，涉及多条通路，其中包括wnt、Hedgehog和IGF-1等重要信号通路的丝/苏氨酸蛋白激酶。其参与的通路可涉及细胞分化增殖调节，形态发育，诱导性神经退化疾病如阿尔茨海默病(AD)，糖原代谢病如二型糖尿病(Type II Diabetes)，细胞有丝分裂，卫星细胞增殖分化，机体创伤修复，癌症发生等多个方面，在医学生物学等相关领域有重要的影响。GSK-3基因主要有两个亚型，即GSK-3a和GSK-3 β。二种亚型在催化区域具有98%的同源性，于N-和C-末端略有不同。通过相关实验表明，两种亚型可功能型代偿，但依然有所差异:(I) GSK-3 β在心肌细胞分化，心脏发育左右对称性，心脏摆位等过程中起主导作用；在超负荷压力下两种亚型磷酸化表现有所区别；(2)在胰岛素信号转导途径中，GSK-30通过调节糖原合酶的活性来影响糖原的合成，两种亚型在肝糖原代谢中作用程度中有一定差异；(3)GSK-3两种亚型对细胞分化增殖及心血管发育影响有所不同；
(4)在脑神经发育方面，GSK-3 β的高表达与双向情感障碍(bipolar disorder)、阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease)等相关神经系统疾病关系更为密切；(5) GSK-3 β在Wnt/β-catenin信号转导中起着重要作用，通过该通路对胚胎干细胞系发育的作用也有一定差异。目前，除了人与小鼠，GSK-3亚型在其他物种中的相关研究还非常有限。由此可见，在不同物种中深入探索GSK3-0相关特性会为相关病理学与生理学研究打下良好的基础。
[0003]RT-PCR克隆:是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式反应以及分子克隆相结合的一种技术。首先利用反转录酶将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板，扩增我们需要的目的基因片段，然后将此片段与载体连接转化到感受态细胞中进行克隆，获得的质粒PCR产物进行测序。此技术利用PCR技术能在体外进行有效的基因扩增，而不需要内切酶消化和连接酶处理，能够快速获得其它依靠限制性内切酶消化法难于得到的PCR产物；同时该方法能克服普通PCR产物测序引物近端的十几个碱基无法测序获得的缺点。与RACE(cDNA末端快速扩增)技术相比较而言，目的基因片段的长度明确，成本较低，工作量小。该技术的关键是PCR引物的设计，在起始密码子的上游设计正向引物，在终止密码子的下游设计反向引物，使得PCR产物能包含完整的基因编码区全序列。
[0004]获得目的基因编码区序列一般采用克隆或RACE技术，RACE技术是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过向两端延伸扩增从而获得完整的3’端和5’端。但该技术与克隆技术相比，目的基因片段的长度不明确，试验成本高，工作量大，对于提取的RNA质量要求较高，因此应用相对较少。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、快速获取南江黄羊GSK-3 β基因完整编码区序列的方法，填补在南江黄羊上该基因研究的空白，为进一步研究其在南江黄羊上的功能奠定基础。
[0006]本发明采用以下技术方案:
一种克隆南江黄羊GSK-3 0基因编码区全序列的方法，包括以下步骤:
Al、从南江黄羊肝脏组织样品中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA ；
A2:以绵羊该基因的序列为模板在起始密码子上游区域和终止密码子的下游区域设计引物；
A3:以cDNA为模板进行PCR扩增；
A4:扩增产物的胶回收和纯化；
A5:纯化的产物进行克隆与测序，即能得到南江黄羊GSK-3 0基因的编码区全序列。
[0007]所述的方法，步骤Al包括以下步骤:取用液氮研磨好的组织粉末约80mg，加入预先盛有ImL Trizol的EP管中，振荡混匀后，室温静置5min ;加氯仿0.2mL(必须按总体积的1/5)，旋涡仪振荡混匀15秒，室温静置5min ;4°C下12000rpm离心15min ;转移上层水相450μ?于另一个新的1.5mLEP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静置1min ；4°C下12000rpm离心1min ;弃去上层清液后，加入4°C预冷的75%乙醇(用DEPC处理水配制)ImL,静置5η?η,4.?下7500g离心5min ;弃上清,用枪吸取多余的液体,空气干燥约3min ;力口入30μ? DEPC处理水，吹打混匀，充分溶解RNA，然后立即反转录成cDNA。
【附图说明】
[0008]序列表SEQ ID NO:1,山羊GSK-3 β基因序列。
[0009]图1是山羊GSK-3 β基因的PCR产物电泳图。
【具体实施方式】
[0010]具体实施步骤:
1、组织样的采集
选取出生后120d的南江黄羊进行宰杀，取其肝脏组织样品后迅速置于液氮中保存待用。
[0011]2、总RNA的提取和cDNA的合成
(O取用液氮研磨好的组织粉末80mg,加入预先盛有ImL Trizol的EP管中，振荡混勻后，室温静直5min ；
(2)加氯仿0.2mL(必须按总体积的1/5)，旋涡仪振荡混匀15秒，室温静置5min ;
[0024](3)4°C下 12000rpm 离心 15min ；
(4)转移上层水相450μ?于另一个新的1.5mLEP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静置1min ；
(5)4°C下 12000rpm 离心 1min ；
(6)弃去上层清液后，加入4°C预冷的75%乙醇(用DEPC处理水配制)lmL，静置5min，
(7)4°C下 7500g 离心 5min ；
(8)弃上清，用枪吸取多余的液体，空气干燥约3min;加入30μ? DEPC处理水，吹打混匀，充分溶解RNA。
[0012](9)用1%的琼脂糖凝胶电泳法检测总RNA的质量，效果好的立即反转录成cDNA。
[0013]3、目的基因片段的扩增
(1)引物的设计:根据GenBank数据库中公布的绵羊(6￥i5.aries )的GSK-3 β(NMJ)Ol 129740
)基因序列,采用Primer Premier 5.0软件设计引物,设计的引物为:
正向引物:5’ ATGTCAGGGCGGCCCAGAA 3’
反向引物:5’ GACCAGTGTTGCTGAGTGAC 3’
(2)PCR的反应体系和条件:反应体系(30μυ: 15 μ?的2XTaq PCR Master Mix，正反向引物各I KL，11.5 μ?的灭菌ddH20，模板cDNA 1.5 μ?。反应条件为95°C预变性4 min,36 个循环(95°C，40 s ；62°C,40 s ；72°C,60 s)，最后 72°C 7 min;PCR 产物用 1.5% 的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
[0014]4、PCR产物的回收和纯化
PCR产物用上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒纯化回收，具体步骤为:
(I)通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5 mL离心管中。
[0015](2)称量凝胶的重量，根据胶块的重量和浓度，按每10mg琼脂糖加400μ?的比例加入 Binding Buffer II。
[0016](3)将离心管置于55 °C金属恒温浴中5?10 min,间或混匀，直至胶块完全溶化。
[0017](4)(可选步骤)当目的片段<500bp时,加入所使用的Binding Buffer II 1/3体积的异丙醇混匀。当目的片段>500bp时，此步骤可以省略，直接进行步骤(5)。
[0018](5)将溶化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2 min。8000 rpm室温离心I min。
[0019](6)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入 500 M-L Wash Solut1n, 10000 rpm 室温离心 I min。
[0020](7)重复步骤(6) —次。
[0021](8)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12000 rpm 室温离心 2 min。
[0022](9)将UNIQ-10柱放入一新的1.5 mL离心管中，在吸附膜中央加30 μ? Elut1nBuffer,室温放置I?2 min。12000 rpm室温离心I min,离心管中的液体即为回收的DNA片段。
[0023](10)取收集的DNA 2μ?, 1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测回收的DNA质量。
[0024]4、产物的克隆
(O目的片段与载体连接
将7μ?胶回收产物与2PL PMD19-T载体、?μ?连接酶连接。将载体在冰上融化，短暂离心装有载体的离心管，以免液体挂在管壁上。在超净操作台上配置连接液。将反应混合液置于16°C水浴锅中连接3h。
[0025](2)连接产物的转化
从_80°C冰箱取出保存的感受态细胞DH5 α冰浴助融，吸取50μ?加入到ΙΟμ?连接液中，轻轻旋转混匀。
[0026]冰上放置30min。
[0027]热激转化:42°C加热45 s后，放在冰上I?2min。
[0028]加入预先保存在37°C的LB培养基800μ?于37°C振摇培养45min。
[0029]室温下4000g离心1min,吸掉上清液600μ?。
[0030]吸取连接产物到平板上均匀涂布，液体被完全吸收后倒置于37°C的培养箱中培养
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[0031](3)阳性克隆的筛选
用灭过菌的牙签挑取单个菌落，接种于含有Amp的800μ? LB培养基中，37 °C，200r/min振荡培养5 h后吸取I PL菌液作PCR模板，依据PCR扩增的体系和条件进行PCR鉴定，产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳来检测。依据菌液PCR检测结果，吸取含有阳性克隆的菌液600μ?，送往上海立菲生物技术有限公司广州测序部进行测序。
[0032]将测序结果使用DNAstar软件进行校对拼接，寻找基因的起始密码子与终止密码子，得到的GSK-30基因1333的完整编码区序列，经比对，所得南江黄羊GSK-30基因编码区序列与绵羊一致性达到99%。
[0033]应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【主权项】
1.一种克隆南江黄羊GSK-3 0基因编码区序列的方法，它的核苷酸序列如序列表SEQID NO:1 所述。
2.根据权利要求1所述，扩增南江黄羊GSK-3i3基因编码区序列的正、反向引物的DNA序列如下所示: 正向引物:5’ ATGTCAGGGCGGCCCAGAA 3’ 反向引物:5’ GACCAGTGTTGCTGAGTGAC 3’。
3.制备如权利要求1所述的基因片段的方法，按照以下步骤:利用NCBI数据库信息，在线比对牛、绵羊GSK-3 0基因，在保守区设计引物，提取南江黄羊肝脏组织总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，之后PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列。
【专利摘要】本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种克隆南江黄羊GSK-3β基因编码区全序列的方法。其编码区核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。本发明还公开了一种南江黄羊GSK-3β基因克隆的方法，包含以下步骤：步骤一，提取南江黄羊肝脏组织中的总RNA，然后将其反转录成cDNA；步骤二，扩增引物的设计及PCR反应；步骤三，扩增产物的回收和纯化；步骤四，克隆。采用上述方案，本发明首次获得了南江黄羊GSK-3β基因完整的编码区序列，该发明也为进一步研究南江黄羊GSK-3β基因的功能奠定理论基础。
【IPC分类】C12N15-10, C12N15-54
【公开号】CN104694555
【申请号】CN201310638324
【发明人】侯郁果, 王林杰, 张红平, 李利, 仲涛, 王艳
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年12月4日