一种艾塞那肽衍生物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及治疗性多肽领域，具体涉及新型长效艾塞那肽衍生物及其制备方法， 同时还涉及这些衍生物的医疗用途。
【背景技术】
[0002] 艾塞那肽是一种从美洲希拉巨蜥（Heloderma suspectum)唾液中分离得到的含有 39个氨基酸的天然多肽激素，序列结构为：
[0003] HGEGT5FTSDL1CISKQME15EEAVR 2〇LFIEW25LKNGG3〇PSSGA35PPPS，与 GLP-1 有 53 % 的序列 同源性，不但具有类似GLP-1促胰岛素分泌的功能，而且其体内稳定性也远高于GLP-1。根 据艾塞那肽的这一特点，美国Amylin公司和Eli Lilly公司联合开发了化学合成药物艾塞 那肽，又称Exenatide，商品名Byetta。Byetta是世界上首个肠促胰岛素类似物药物。于 2005年4月经美国FDA比准上市。研究表明，艾塞那肽不仅能很好的控制血糖，还可促进 胰岛细胞的新生和增值，减少0细胞凋亡，改善0细胞功能，具有非常明显的临床应用优 势。此外，临床研究中发现艾塞那肽还能够减慢胃肠排空的速度，使人没有饥饿感而减少摄 入食物，从而减轻体重。
[0004] 艾塞那肽需要每天注射两次，在临床使用中非常不方便。为了解决这一问题，目前 已有许多研究，通过对艾塞那肽进行结构修饰，来延长其在体内的药效作用时间。比如，通 过其氨基酸侧链进行聚乙二醇化修饰，或与长链脂肪酸偶联，来延长其半衰期；或者开发艾 塞那肽缓释微球制剂等。这些方法虽然能够延长药效作用时间，但是改造后分子往往存在 药效降低、副作用增加等问题，因而需要开发能够有效延长药效时间，同时具有更好的活性 与疗效的新的艾塞那肽衍生物。
[0005] 通过对艾塞那肽与其受体蛋白GLP-1R的结合方式与结合位点的研究表明，艾塞 那肽序列从Leu 1(l到Asn 28形成一段两亲性a -螺旋结构，位于疏水面的Val 19Phe22、lie23、 Leu26与GLP-1R的疏水空腔相互作用，位于亲水面的Arg 2°、Lys27通过氢键与GLP-1R相互 作用，这些氨基酸残基是重要的活性位点。艾塞那肽这种a-螺旋结构对于保持其生物活 性极为重要。然而化学合成的多肽通常都是一段无序的结构，很难保持其在生理条件下的 二级结构。因此，通过发展合适的化学修饰方法，来稳定合成多肽的a-螺旋结构，一方面 可以增强其与受体的亲和力，另一方面，还能大幅提升多肽的抗蛋白水解能力，这种方法在 多肽药物改造方面具有重要的潜在应用价值。通常可以通过在多肽序列合适的位置侧链成 环的方式来稳定多肽的a -螺旋结构，侧链一般在多肽a -螺旋的同一面上，侧链氨基酸的 位置一般为i/i+3, i/i+4, i/i+7, i/i+11等，其中应用较多的是i/i+4和i/i+7。
[0006] 本发明以艾塞那肽为模板，通过用Cys替换i/i+4位置上的氨基酸，然后通过连接 臂侧链成环的策略，来稳定艾塞那肽的a-螺旋结构。通过这种方法得到的艾塞那肽衍生 物，在保留良好的体内降糖活性的同时，解决了天然艾塞那肽体内半衰期短的问题，这种艾 塞那肽衍生物在治疗和预防糖尿病的药物中具有更大的应用潜力。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的是针对临床上艾塞那肽在体内半衰期短，需要频繁注射给药的 缺陷，提供一种作用时间更长、疗效更好的艾塞那肽衍生物。
[0008] 本发明的另一个目的是提供该艾塞那肽衍生物的制备方法。
[0009] 本发明的又一个目的是提供该艾塞那肽衍生物在治疗/预防糖尿病的药物中的 应用。
[0010] 用于实现上述目的的技术方案如下：
[0011] 本发明提出了一种艾塞那肽衍生物，所述衍生物为在相对于序列艾塞那肽第i和 i+4的位置上的氨基酸用Cys替换，然后通过连接臂（linker)成环后形成的化合物，其中i 的取值为10,12,13,14,16, 20, 24,所述连接臂（linker)选自化学式1-4 :
【主权项】
1. 一种艾塞那肽衍生物，所述衍生物为在相对于序列艾塞那肽第i和i+4的位置上的 氨基酸用Cys替换，然后通过连接臂（linker)成环后形成的化合物，其中i的取值为10， 12,13,14,16, 20, 24,所述连接臂（linker)选自化学式1-4 :
2. 根据权利要求1所述的艾塞那肽衍生物，其特征在于： 当i= 10时窠那肽衍牛物的结构如式所示：
其中，当连接臂（linker)的结构为化学式1时,对应的艾塞那肽衍生物记为la;当连 接臂（linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为lb;当连接臂（linker)的 结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为Ic;当连接臂（linker)的结构为化学式4 时，对应的艾塞那肽衍生物记为Id; 当i= 12时，艾塞那肽衍生物的结构如式（II)所示：
其中，当连接臂（linker)的结构为化学式1时,对应的艾塞那肽衍生物记为Ila;当连 接臂（linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为lib;当连接臂（linker) 的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为lie;当连接臂（linker)的结构为化学 式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为lid; 当i= 13时，艾塞那肽衍生物的结构如式（III)所示：
其中，当连接臂（linker)的结构为化学式1时，对应的艾塞那肽衍生物记为Ilia; 当连接臂（linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为Illb;当连接臂 (linker)的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为IIIc;当连接臂（linker)的结 构为化学式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为Illd; 当i= 14时，艾塞那肽衍生物的结构如式（IV)所示：
其中，当连接臂（linker)的结构为化学式1时,对应的艾塞那肽衍生物记为IVa;当连 接臂（linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为IVb;当连接臂（linker) 的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为IVc;当连接臂（linker)的结构为化学 式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为IVd; 当i= 16时，艾塞那肽衍生物的结构如式（V)所示： 其中，当连接臂（linker)的结构为化学式1
时,对应的艾塞那肽衍生物记为Va;当连 接臂（linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为Vb;当连接臂（linker)的 结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为Vc;当连接臂（linker)的结构为化学式4 时，对应的艾塞那肽衍生物记为Vd; 当i= 20时，艾塞那肽衍生物的结构如式（VI)所示：
其中，当连接臂（linker)的结构为化学式1时,对应的艾塞那肽衍生物记为Via;当连 接臂（linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为VIb;当连接臂（linker) 的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为Vic;当连接臂（linker)的结构为化学 式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为VId; 当i= 24时，艾塞那肽衍生物的结构如式（VII)所示：
其中，当连接臂（linker)的结构为化学式1时，对应的艾塞那肽衍生物记为Vila; 当连接臂（linker)的结构为化学式2时，对应的艾塞那肽衍生物记为Vllb;当连接臂 (linker)的结构为化学式3时，对应的艾塞那肽衍生物记为Vile;当连接臂（linker)的结 构为化学式4时，对应的艾塞那肽衍生物记为Vlld。
3. 根据权利要求1所述的艾塞那肽衍生物的合成方法，其特征在于，包含以下步骤： (1) 相对于序列艾塞那肽第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替换的线性多肽的固相 合成； (2) 步骤（1)得到的Cys替换的线性多肽与连接臂反应成环，经HPLC纯化、冷冻干燥得 到所述的艾塞那肽衍生物。
4. 根据权利要求2所述的艾塞那肽衍生物的合成方法，其特征在于，步骤（1)中，先将 用于多肽合成的树脂置于固相反应器，再将带保护的氨基酸单体按照权利要求1或2所述 序列，从C端到N端依次偶联，合成带侧链保护基的线性多肽树脂，再经脱除保护基、切断树 月旨、HPLC纯化，得到第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替换的艾塞那肽线性多肽衍生物。
5. 根据权利要求2所述的艾塞那肽衍生物的合成方法，其特征在于，步骤（2)中，将步 骤（1)中得到的第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替换的艾塞那肽（7-37)线性多肽衍 生物溶解于体积比为（〇. 1~10) : 1的乙腈-水的混合溶液中，调节pH值至7. 5~8. 5， 然后加入5~10摩尔当量的连接臂，室温下反应0. 5~4小时，经HPLC纯化、冷冻干燥得 到艾塞那肽衍生物。
6. 根据权利要求2所述的艾塞那肽衍生物的合成方法，所述的带保护的氨基酸单体选 自于：Fmoc-Ser(tBu)-〇H, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-〇H， Fmoc-Lys (Boc)-OH, Fmoc-Leu-〇H, Fmoc-Trp (Boc)-OH, Fmoc-Glu (OtBu)-OH, Fmoc-Ile-〇H, Fmoc-Phe-〇H, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-〇H, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Met-〇H, Fmoc-Asp(OtBu) -OH, Fmoc-Thr(tBu) -OH, Fmoc-His(Trt)-OH。
7. 如权利要求1所述的艾塞那肽衍生物在制备治疗糖尿病的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种艾塞那肽衍生物。本发明还公开了上述艾塞那肽衍生物的制备方法和应用，所述衍生物为在相对于序列艾塞那肽第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替换，其中i的取值为10，12，13，14，16，20，24，然后通过连接臂成环后形成的化合物。本发明制备的艾塞那肽衍生物具有长于艾塞那肽的体内降糖时间，特别适于在制备治疗糖尿病和肥胖症的药物中作为该药物的活性成分。
【IPC分类】A61K38-22, C07K14-575, A61P3-10
【公开号】CN104693301
【申请号】CN201510074773
【发明人】苏贤斌, 李金科, 杨敏敏, 汤同洋, 郭伦迪
【申请人】南京工业大学, 南京英沛生物技术有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月9日