细胞的培养方法及其应用
【专利说明】细胞的培养方法及其应用
[0001]本申请是申请号为200580039543.3，申请日为2005年6月8日的同名申请的分案申请。
技术领域
[0002]本发明涉及细胞的培养方法及其应用，更具体而言，涉及细胞的培养方法和应用该方法在细胞中生产蛋白质的方法。
【背景技术】
[0003]培养动物细胞，想要得到由该动物细胞产生的天然型蛋白质的情况下，或者培养导入了编码期望的蛋白质的基因的动物细胞，以制备期望的蛋白质等的情况下，除了盐类、糖类、氨基酸类、以及维生素类等的基础营养物之外，为了使该动物细胞增殖，通常将来源于哺乳动物的提取物、具体而言，在5?20%的范围内将胎牛血清等血清添加到培养基中。不过，所涉及的来源于哺乳动物的血清存在占培养基的成本的75?95%、且常因为品质有批次间的差异不能获得稳定的增殖的缺点。此外，由于来自哺乳动物的血清不能用高压灭菌器等设备灭菌，可能会被病毒或者支原体污染，尽管其中多数是无害的，但将成为附加于稳定生产方面的重要的未知因素。此外，血清中含有500种以上的蛋白质，由于这个原因，造成了从培养中的培养基分离、纯化作为细胞产物的所期望的蛋白质的复杂化。为了消除此类在稳定生产上的问题，进行了使用胎球蛋白、胰岛素、转铁蛋白等的来源于血清的纯化的蛋白质以替代血清的方法。此外，从制备成本的观点出发，也尝试了使用从哺乳动物提取的培养基成分的方法。
[0004]不过，由于近年来对于来源于哺乳动物的成分，存在与疯牛病(mad cowdisease)、牛海绵状脑症(Bovine Spongiform Encephalopathy:BSE)、传染性海绵状脑症(Transmissible Spongiform Encephalopathy:TSE)、或者人海绵状脑病(Creutzfeld —Jakob Disease:CJD)等有关的担心，所以从安全性的观点出发，期望出现一种不含有这些来源于哺乳动物的成分的动物细胞培养用培养基。
[0005]培养动物细胞的时候，如果不向使用的培养基中添加上述这样的来源于哺乳动物的成分的话，将会发生下述问题:在培养的早期细胞的生存率的显著降低，培养液中的活细胞数减少，因而不能进行长期培养或者大量培养。
[0006]为了解决上述问题，报道了向培养用培养基中添加鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的方法(专利文献1、2)。通过该方法，即使不用使用通常必须使用的胎牛血清，也可以高产量地生产蛋白质。
[0007]不过从制备成本的角度出发，优选尽可能提高蛋白质的产量的情况，因此期待得到进一步的改良。
[0008]专利文献1:国际公开第99/63058号小册子
[0009]专利文献2:特开2003 - 334068号公报
【发明内容】
[0010]发明所要解决的问题
[0011]本发明的目的在于，通过使用含有鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的培养基进行流加培养，在细胞中高产量地生产蛋白质。
[0012]用于解决问题的方法
[0013]本发明人等为了解决上述课题，进行了深入研宄，结果发现通过使用添加了鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的培养基进行流加培养，能够在细胞中以更高的产量产生期望的蛋白质，由此完成了本发明。
[0014]本发明的内容如下所示。
[0015](I)细胞的培养方法，其特征在于，在用初始培养基开始细胞的培养，并向正在进行细胞培养的培养基中再至少加入一次流加培养基的培养方法中，向初始培养基或者流加培养基的至少一方中添加鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。
[0016](2)细胞的培养方法，其特征在于，用添加了鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的培养基开始细胞的培养，向正在进行细胞培养的培养基中再至少加入一次鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。
[0017](3)第⑵项中记载的培养方法，其中，使用流加培养法培养细胞。
[0018](4)第⑴?(3)的任一项中记载的培养方法，其中，细胞是导入了编码期望的蛋白质的基因的细胞。
[0019](5)第(4)项中记载的培养方法，其中，所期望的蛋白质是抗体。
[0020](6)第(I)?(5)中任一项所记载的培养方法，其中，细胞是动物细胞。
[0021](7)第(6)项中记载的培养方法，其中，细胞是哺乳动物细胞。
[0022](8)第(7)项中记载的培养方法，其中，哺乳动物细胞是CHO细胞。
[0023](9)制备方法，是使用初始培养基开始细胞的培养，通过向正在进行细胞培养的培养基中再至少加入一次流加培养基以培养细胞的制造蛋白质的方法，其特征在于，在初始培养基或者流加培养基的至少一方中添加鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。
[0024](10)蛋白质的制备方法，其特征在于，用添加了鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的培养基开始细胞的培养，向正在进行细胞培养的培养基中再至少加入一次鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。
[0025](11)第(10)项中记载的制备方法，其中，用流加培养法培养细胞。
[0026](12)第(9)?(11)中任一项记载的制备方法，其中，细胞是导入了编码期望的蛋白质的基因的细胞。
[0027](13)第(12)项记载的制备方法，其中，所期望的蛋白质是抗体。
[0028](14)第(9)?(13)中任一项记载的制备方法，其中，细胞是动物细胞。
[0029](15)第(14)项中记载的制备方法，其中，细胞是哺乳动物细胞。
[0030](16)第(15)项中记载的制备方法，其中，哺乳动物细胞是CHO细胞。
[0031]发明的效果
[0032]在本发明中，通过不仅向在细胞的培养开始时的培养基中添加鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物，还向正在进行细胞培养的培养基中加入鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物，能够以更高的产量在细胞中生产期望的蛋白质。
[0033]本说明书包括作为本申请的优先权的基础的日本专利申请、特愿2005 - 000747号的说明书以及/或者附图所记载的内容。
【附图说明】
[0034]图1是表示使用添加了 5g/L狐鲣水解物的不含来自哺乳动物成分的培养基(初始培养基)以及添加了 30g/L狐鲣水解物的不含来自哺乳动物成分的培养基(流加培养基)培养的CHO细胞在培养基中产生的抗体蛋白质浓度(g/L)的图。
[0035]图2是表示用添加了 15g/L狐鲣水解物的不含来自哺乳动物成分的培养基(初始培养基)以及添加了 75g/L狐鲣水解物的不含来自哺乳动物成分的培养基(流加培养基)培养的CHO细胞在培养基中产生的抗体蛋白质浓度(g/L)的图。
[0036]图3是表示用添加了 5g/L狐鲣水解物的不含来自哺乳动物成分的培养基(初始培养基)以及添加了 30g/L狐鲣水解物的不含来自哺乳动物成分的培养基(流加培养基)培养的CHO细胞在培养基中产生的抗体蛋白质浓度(g/L)的图。
【具体实施方式】
[0037]下面对本发明的实施方式进行更详细的说明。
[0038]在本发明中以初始培养基开始细胞的培养，然后，向正在进行细胞培养的培养基中至少一次加入流加培养基。此处，初始培养基或者流加培养基的至少一方添加有鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。
[0039]此外，作为本发明的优选的实施方案，使用添加了鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的培养基开始细胞的培养，然后，向正在进行细胞培养的培养基中至少I次加入鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。
[0040]根据本发明，即使不在目前通常作为动物细胞培养用培养基使用的培养基中添加来源于哺乳动物细胞的成分，也能很好地进行细胞的培养。
[0041]通常，细胞培养的方法分类为分批法(batch culture)、连续法(continuousculture)、流加培养法(fed — batch culture)。本发明的方法中可以使用任何一种培养方法，但优选使用流加培养法或者连续法，特别优选使用流加培养法。
[0042]分批法是向培养基中加入少量的种培养液，在培养过程中添加新的培养基或者不排出培养液，使细胞增殖的培养方法。
[0043]连续法是在培养过程中连续地加入培养基，并且连续地使之排出的培养方法。需要说明的是，连续法也包含灌流培养。
[0044]流加培养法因为介于分批法和连续法之间，所以也称为半分批法(semi — batchculture)，是在培养过程中连续地或者逐次地加入培养基，但不像连续法那样地进行连续的培养液的排出的培养方法。流加培养的时候加入的培养基(以下称为流加培养基)无需是和已经在培养中使用的培养基(下面称为初始培养基)相同的培养基，可以添加不同的培养基，也可以仅添加特定的成分。
[0045]本发明中初始培养基指的是通常在细胞培养的最初的阶段所使用的培养基。不过在多次分开添加流加培养基成分的情况下，也可以将分别添加流加培养基之前的培养基作为初始培养基。
[0046]在本发明的方法中，采用流加培养法的情况下，可以在流加培养基或者初始培养基的任何一方中含有鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物，但优选在流加培养基以及初始培养基二者中含有鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物。此外，与初始培养基中的鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的浓度相比较，优选流加培养基中的鱼肉的酶分解物或者鱼肉的提取物的浓度高。初始培养基中的鱼肉的酶分解物或者鱼肉提取物的浓度通常在I?30g/L是适当的，优选3?20g/L、更优选5?15g/L。流