一种新的重组禽流感病毒h5n1抗原制备的病毒维持液的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及一种新的重组禽流感病毒H5N1抗原 制备的病毒维持液。
【背景技术】
[0002] 现行的禽流感H5N1灭活疫苗主要是在鸡胚上进行培养，收获尿囊液，灭活后制备 成成品疫苗。这种方法存在一些弊端：鸡胚分离流感病毒或传代易引起病毒变异；鸡胚残 留物可引起过敏性反应；鸡胚作为疫苗生产基质，在大规模生产时，存在潜在的外源病毒污 染问题。但是，传统的细胞源疫苗所用病毒维持液一般与原细胞培养液成分一致，只是降 低了血清的浓度；而目前研宄的重组禽流感H5N1灭活疫苗是在原有细胞培养基上接毒，获 得的重组禽流感H5N1病毒，其效价一般不高，达不到现行鸡胚疫苗规程的效价（Re-6株和 Re-4株病毒液HA效价不低于1:256者方可用于制苗）。
[0003] 文献检索披露：中国农业科学院哈尔滨兽医研宄所刘明等人，进行了重组H5N3禽 流感疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖条件研宄，文章未涉及对禽流感鸡胚毒在MDCK细胞 上的驯化及病毒维持液。另外华东理工大学黄锭等人"用于流感疫苗生产的MDCK细胞无 血清单细胞悬浮培养体系的开发"及东北林业大学博士后流动站的李春艳微载体规模化培 养MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的研宄等大量文章，也均未涉及对禽流感鸡胚毒在 MDCK细胞上的驯化和接毒前对原细胞营养液的置换，病毒维持液也完全不同。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于：采用一种新的重组禽流感H5N1的病毒维持液，可以稳定高效 价地增殖重组禽流感H5N1病毒。整个病毒培养过程所获得的抗原，可以达到现行禽流感疫 苗规程所规定的较高效价，该病毒维持液也用于禽流感鸡胚毒在贴壁MDCK细胞上的细胞 种毒的驯化，同时在反应器上大规模增殖禽流感病毒也具有重要的应用价值。
[0005] 本发明的目的是这样实现的：一种新的重组禽流感病毒H5N1抗原制备的病毒维 持液，所述的病毒维持液包括下述组分：6.5gDMEM(高糖）干粉培养基、5. OgDMEM(低糖） 干粉培养基、注射用水l〇〇〇ml、20mM H印es及2mg TPCK配置液；所述的TPCK配置液由10g TPCK干粉，加入50ml pH值为7. 2的PBS溶液配制成规格为2mg/ml的TPCK配置液；所述 的PBS溶液由氯化钠8. 0g、氯化钾0. 2g、磷酸氢二钠1. 25g、磷酸二氢钾0. 2g、用注射用水 1000ml配制而成。
[0006] 本发明的有益效果：本发明采用的一种新的重组禽流感H5N1的病毒维持液，用于 生长良好的贴壁MDCK细胞的接毒培养，可以稳定高效价地增殖重组禽流感H5N1病毒。整 个病毒培养过程所获得的抗原，可以达到现行禽流感疫苗规程所规定的较高效价，该病毒 维持液对禽流感鸡胚毒在贴壁MDCK细胞上的细胞种毒的驯化也具有关键作用，同时在反 应器上大规模增殖禽流感病毒也具有重要的应用价值。同时，通过大量试验证明本发明研 制的重组禽流感H5N1细胞源灭活疫苗抗原制备的病毒维持液，对禽流感病毒的增殖达到 现行鸡胚疫苗规程的效价起到至关重要的作用。解决了文献中常规接毒无法获得高效价病 毒抗原的缺点。
【具体实施方式】
[0007] 实施例1、一种新的重组禽流感病毒H5N1抗原制备的病毒维持液，所述的病毒维 持液包括下述组分：6.5gDMEM(高糖）干粉培养基、5. OgDMEM(低糖）干粉培养基、注射用水 1000ml、20mM H印es及2mg TPCK配置液；所述的TPCK配置液由10g TPCK干粉，加入50ml pH值为7. 2的PBS溶液配制成规格为2mg/ml的TPCK配置液；所述的PBS溶液由氯化钠 8. 0g、氯化钾0. 2g、磷酸氢二钠1. 25g、磷酸二氢钾0. 2g、用注射用水1000ml配制而成。
[0008] 具体实验验证：其1贴壁MDCK细胞的制备：取细胞密度为2. OX 106个/ml的MDCK 冻存管（1. 〇ml)，置于37°C水浴中，晃动溶解2-3分钟，在1000r/min条件下，离心5分钟， 弃去上清，加入l〇-15ml细胞培养液，转入75cm 2培养瓶中，置于37°C、5%的C0 2培养箱中， 培养72小时，形成致密单层备用。也可用浓度0. 25%的EDTA-胰酶消化细胞，进行适当传 代，直至达到所需的数量。
[0009] 其2病毒液的制备：取其1中制备的致密单层细胞，用PH7. 2的无菌PBS溶液清洗 两遍，加入3ml病毒维持液，然后按M0I (病毒感染复数）1(T4~1(T5接种驯化好的重组禽流 感H5N1 Re-6株或Re-4株细胞种毒，旋紧瓶盖，置于37°C、5%的0)2培养箱中，吸附1小时， 然后用病毒维持液补至l〇ml，置于37°C、5%的0) 2培养箱中，培养72~96小时，当细胞病 变达到75%以上时收毒。无菌取样，红细胞血凝抑制法测定HA效价。
[0010] 上述细胞营养液由13. OgDMEM(高糖）干粉培养基，用注射水配制成1000ml，过滤 除菌后加入新生牛血清l〇〇ml配制而成。
[0011] 上述病毒维持液由6. 5gDMEM(高糖）+5. OgDMEM(低糖）干粉培养基，用注射用水 配制成1000ml，调整pH7. 2~7. 4,临用前分别加入20ml的1M H印es (磷酸缓冲液）（终浓 度 20mM H印es)和 lml 的 2mg/ml 的 TPCK(终浓度 2ug/mlTPCK)。
[0012] 上述2mg/mlTPCK的配制由lOgTPCK干粉，加入50mlpH7. 2的PBS溶液，完全溶解 后过滤除菌，分装成lml/支的小包装，-20°C冻存。
[0013] 上述pH7. 2的PBS溶液由氯化钠：8. 0g氯化钾：0. 2g磷酸氢二钠：1. 25g磷酸二氢 钾：0. 2g用注射用水配制成1000ml配制而成。
[0014] 上述1 %红细胞悬液制备：采取2-4只2-6月龄SPF鸡血液，与等量阿氏液混合， 15001'/111；[11，离心10分钟。用0.85%生理盐水离心洗绦3-4次，每次15001'/111；[11，离心10分 钟，将沉积的红细胞用0. 85%生理盐水制成1 %悬液。
[0015] 上述阿氏液配制：柠檬酸钠8g、柠檬酸0. 325g、葡萄糖20. 5g、氯化钠4. 2g、蒸馏水 1000ml。将上述成分溶化、过滤、分装。
[0016] 上述M0I感染复数计算方法：病毒数量与细胞数量的比值，算式如下： 种毒所需体积（ml)=(细胞数XM0I)/种毒的TCID5Q 上述选用的MDCK细胞购自美国ATCC ;DMEM(高糖）干粉培养基为Hyclone公司生产，货 号：AXM51149EC ;DMEM(低糖）干粉培养基为Hyclone公司生产，货号：AWK25188RC ;新生牛 血清为兰州百灵公司生产，货号：20130410 ;EDTA-胰酶消化液为GIBC0生产，货号400660 ; TPCK为Sigma公司生产，货号：T8802。其他常用试剂均为国产分析纯试剂；Hepes磷酸缓冲 液为Hyclone公司生产，货号：AZD189225〇
[0017] 本发明方法验证：禽流感病毒液在不同条件下接种MDCK细胞后病毒HA效价对比 见表1。
[0018] 表1最初3批次禽流感病毒液接种贴壁MDCK细胞后病毒HA效价
【主权项】
1. 一种新的重组禽流感病毒H5N1抗原制备的病毒维持液，其特征在于：所述的病毒维 持液包括下述组分：6. 5gDMEM(高糖）干粉培养基、5. OgDMEM(低糖）干粉培养基、注射用 水1000ml、20mM H印es及2mg TPCK配置液；所述的TPCK配置液由IOg TPCK干粉，加入 50ml pH值为7. 2的PBS溶液配制成规格为2mg/ml的TPCK配置液；所述的PBS溶液由氯 化钠8. 0g、氯化钾0. 2g、磷酸氢二钠 I. 25g、磷酸二氢钾0. 2g、用注射用水1000 ml配制而 成。
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及一种新的重组禽流感病毒H5N1抗原制备的病毒维持液，所述的病毒维持液包括下述组分：6.5gDMEM(高糖)干粉培养基、5.0gDMEM(低糖)干粉培养基、注射用水1000ml、20mM Hepes及2mg TPCK配置液；所述的TPCK配置液由10gTPCK干粉，加入50mlpH值为7.2的PBS溶液配制成规格为2mg/ml的TPCK配置液；所述的PBS溶液由氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.25g、磷酸二氢钾0.2g、用注射用水1000ml配制而成。本发明主要用于重组禽流感病毒H5N1抗原制备过程中。
【IPC分类】C12N1-04, C12N7-00
【公开号】CN104651233
【申请号】CN201510033459
【发明人】王玉红, 李延涛, 李莉, 袁萍, 张先锋, 黄炯, 潘毅平, 赵海源, 刘淑梅
【申请人】新疆天康畜牧生物技术股份有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年1月22日