用于检测艰难梭菌的组合物和方法

用于检测艰难梭菌的组合物和方法
【专利说明】用于检测艰难梭菌的组合物和方法 发明领域
[0001] 本发明涉及微生物诊断的领域，并且更具体而言，涉及艰难梭菌（CAostrit/iwffi t/iiTicih)的检测。
[0002] 发明背景 艰难梭菌（C/ostrit/itt? ￡/i//ici7e)( "艰难梭菌（C ￡/i//ici7e)" 或"艰难梭菌（C 沿//) "）是一种厌氧、革兰氏阳性、形成孢子的细菌，其可引起严重的腹泻和其他肠道疾病。 艰难梭菌孢子经常在医院中发现，并且尽管孢子不能直接引起感染，但它们当被摄取时可 以转化为活跃感染形式。艰难梭菌感染包括广泛范围的临床症状，从简单腹泻到与显著的 发病率和死亡率相关的假膜性结肠炎。抗生素相关的结肠炎是艰难梭菌引起的结肠感染， 其发生在肠道菌群中的竞争性细菌已经被抗生素清除时。它是患者当他们在医院中时获取 的最常见感染。
[0003] 大多数艰难梭菌感染发生在年龄为65岁或以上的人之间和卫生保健设施诸如 医院和养老院中的患者之间。从1996年到2009年，年龄为65岁或以上的住院人的艰难 梭菌比率增加200%，其中年龄为65-74岁的那些增加175%，年龄为75-84岁的那些增加 198%，且年龄为85岁或以上的那些增加201%。年龄为85岁或以上的患者间的艰难梭菌比 率显著高于其他年龄组的那些（全国医院出院调查，年度档案，1996年-2009年（National Hospital Discharge Survey, Annual Files, 1996-2009))〇
[0004] 诊断艰难梭菌结肠炎通常涉及检测粪便样品中由艰难梭菌产生的毒素的测试。存 在两种不同的能够引起结肠炎的艰难梭菌毒素，称为毒素和毒素用于 这些毒素的诊断测试是可商购的。然而，这些测试不完美，并且可导致假阳性测试（当不存 在艰难梭菌时发现毒素），且可发生假阴性测试（当存在艰难梭菌时未发现毒素）。例如， 艰难梭菌和索氏梭菌（C sorofeT7ii)之间交叉反应的可能性是已知的。参见，"Cloning and characterization of the cytotoxin L-encoding gene ofClostridiumsordellii: homology withClostridiumdifficilecytotoxin B"，Green 等人，Gene, 1995, 161:57-61)。因此，仍然存在开发用于检测艰难梭菌的分子测试的显著临床需要，所述分子 测试比培养更灵敏，且较不易于获得假阳性或假阴性结果。
[0005] 发明概沐 本发明的实施方案涉及用于快速检测生物或非生物样品中艰难梭菌的存在或不存在 的方法。本发明包括包含进行至少一个循环步骤的艰难梭菌的检测方法，所述循环步骤可 以包括扩增步骤和杂交步骤。此外，本发明涉及设计用于检测艰难梭菌的引物、探针和试 剂盒。在本发明的方法中靶向用于检测艰难梭菌的基因是艰难梭菌毒素B "《/功基因。 例如，选择编码细胞毒素B的基因，因为其被确定为对于产毒素的艰难梭菌是特异性 的，并且不存在于其他梭菌属物种中，例外是索氏梭菌的一些肠毒素阴性、细胞毒素阳性的 菌株（Green,等人，J. Med. Microbiol. 1996，44:60-64)。产毒素的艰难梭菌菌种间 teoB基因的异质性导致多达31种毒素型，迄今包括Tox 0,这是参考菌株VPI 10463。化必 基因编码具有负责结合宿主细胞膜的C-末端结构域、参与内化的中间部分和N-末端催化 (毒性）部分的单链蛋白（Rupnik,等人，Microbiology, 2005，151(1): 199-208)。
[0006] 在一个方面，本发明提供了用于检测样品中的艰难梭菌的方法，所述方法包括：进 行扩增步骤，所述扩增步骤包括使样品与&必引物组接触，如果艰难梭菌存在于样品中， 则产生扩增产物；进行杂交步骤，所述杂交步骤包括使所述扩增产物与一种或多种可检测 的^躲针接触；和检测所述扩增产物的存在或不存在，其中所述扩增产物的存在指示样 品中艰难梭菌的存在，并且其中所述扩增产物的不存在指示样品中艰难梭菌的不存在。在 一个实施方案中，化必引物组的每个引物包含选自SEQ ID N0:l、2、3、4、5和6的核苷酸序 列或其互补序列，或由选自SEQ ID N0:l、2、3、4、5和6的核苷酸序列或其互补序列组成；并 且其中所述一种或多种可检测的针包含选自SEQ ID NO: 7、8和9的核苷酸序列或 其互补序列，或由选自SEQ ID NO: 7、8和9的核苷酸序列或其互补序列组成。在一些实施 方案中，杂交步骤包括使扩增产物与由供体荧光部分和相应的受体荧光部分标记的探针接 触。该方法还可以包括检测探针的供体荧光部分和受体荧光部分之间的荧光共振能量转移 (FRET)的存在或不存在。荧光的存在或不存在指示样品中艰难梭菌的存在或不存在。
[0007] 在一个方面，扩增可以采用具有5'至3'外切核酸酶活性的聚合酶。在某些方面， 第一和第二荧光部分可以沿着探针长度在彼此不超过5个核苷酸内。在另一个方面，化必 探针包括允许二级结构形成的核酸序列。此类二级结构形成通常导致第一和第二荧光部分 之间的空间接近。此方法的某些实施方案中，在探针上的第二荧光部分可以是猝灭剂。
[0008] 在另一个方面，本发明提供了检测来自个体的生物样品中艰难梭菌的存在或不存 在的方法。此类方法通常包括进行至少一个循环步骤，其包括扩增步骤和染料-结合步骤。 通常，所述扩增步骤包括使样品与一对化必引物接触，如果样品中存在核酸分子，则 产生teoST增产物，并且所述染料-结合步骤包括使teoST增产物与双链DNA结合染料接 触。此类方法还包括检测双链DNA结合染料结合至扩增产物中的存在或不存在，其中结合 的存在指示样品中存在艰难梭菌，并且其中结合的不存在指示样品中不存在艰难梭菌。代 表性双链DNA结合染料是溴化乙锭。此外，此类方法还可以包括确定teoST增产物与双链 DNA结合染料之间的解链温度，其中所述解链温度证实艰难梭菌的存在或不存在。
[0009] 在进一步方面，本发明提供了用于检测艰难梭菌的核酸目标）的试剂盒。所 述试剂盒可以包括第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包含选自SEQ ID NO: 1、2和3的序列 或其互补序列，或由选自SEQ ID N0:l、2和3的序列或其互补序列组成；第二寡核苷酸，所 述第二寡核苷酸包含选自SEQ ID N0:4、5和6的序列或其互补序列，或由选自SEQ ID N0:4、 5和6的序列或其互补序列组成；和第三可检测地标记的寡核苷酸，所述第三可检测地标记 的寡核苷酸包含选自SEQ ID N0:7、8和9的序列或其互补序列，或由选自SEQ ID N0:7、8 和9的序列或其互补序列组成。在某些实施方案中，第一和第二寡核苷酸是引物寡核苷酸， 而第三可检测标记的寡核苷酸是探针寡核苷酸。
[0010] 在一个实施方案中，试剂盒可以包括已用供体和相应的受体荧光部分标记的探 针，或可以包括用于标记探针的荧光部分。在某些实施方案中，受体荧光部分是猝灭剂。该 试剂盒还可包括核苷三磷酸、核酸聚合酶和核酸聚合酶功能所需的缓冲液中的至少一种。 该试剂盒还可包括关于使用引物、探针和荧光部分以检测样品中艰难梭菌的存在或不存在 的包装说明书和使用说明书。
[0011] 在一个方面，本发明提供了寡核苷酸，其包含选自SEQ ID勵:1、2、3、4、5、6、7、8和 9的核苷酸序列或其互补序列，或由选自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8和9的核苷酸序列 或其互补序列组成，所述寡核苷酸具有100个或更少的核苷酸。在某些实施方案中，寡核 苷酸具有40个或更少的核苷酸。在另一个方面，本发明提供了寡核苷酸，其包括与SEQ ID 勵:1、2、3、4、5、6、7、8和9之一或其互补序列具有至少70%序列同一性（例如至少75%、80%、 85%、90%或95%等）的核酸，所述寡核苷酸具有100个或更少，更具体地40个或更少的核 苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸与SEQ ID勵:1、2、3、4、5、6、7、8和9之一或其互补序 列具有90%序列同一性。通常，在这些实施方案中，这些寡核苷酸可以是引物核酸、探针核 酸等。在这些实施方案的某些中，寡核苷酸具有40个或更少的核苷酸（例如35个或更少 的核苷酸，30个或更少的核苷酸等）。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个修饰的核 苷酸，例如以相对于未修饰的核苷酸改变核酸杂交稳定性。任选地，寡核苷酸包含至少一个 标记和/或至少一个猝灭剂部分。在一些实施方案中，寡核苷酸包括至少一个保守修饰的 变化。
[0012] 在又另一个方面，本发明提供了寡核苷酸引物对，其中第一寡核苷酸引物包含选 自SEQ ID N0:l、2和3的序列或其互补序列，或由选自SEQ ID N0:l、2和3的序列或其互 补序列组成，且其中第二寡核苷酸引物包含选自SEQ ID N0:4、5和6的序列或其互补序列， 或由选自SEQ ID N0:4、5和6的序列或其互补序列组成。在这些实施方案的某些中，所述 寡核苷酸中的至少一个具有40个或更少的核苷酸（例如35个或更少的核苷酸，30个或更 少的核苷酸等）。在一些实施方案中，所述寡核苷酸中的至少一个包含至少一个修饰的核苷 酸，例如，以相对于未修饰的核苷酸改变核酸杂交稳定性。在一些实施方案中，所述寡核苷 酸中的至少一个包括至少一个保守修饰的变化。
[0013] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通 技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文所述那些相似或等同的方法和材料可以用于本 发明的实践或测试中，但是下文描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和实例仅是举 例说明性的，并且不意图是限制性的。
[0014] 本发明的一个或多个实施方案的细节在下文附随的附图和说明书中阐述。本发明 的其他特征、目的和优点根据附图和详述和权利要求将是显而易见的。
[0015]附图简沐 图1A、1B和1C显示用针对艰难梭菌的毒素B基因的各种引物对产生的PCR产物的凝胶 数据，和与索氏梭菌的交叉反应性的水平；CDB203BZ/CDB202BZ (图1A)，CDN211BZ/CDB214N (图 1B)和 CDB205BZ/CDB204BZ (图 1C)。
[0016] 图2A、2B和2B显示用各种引物对扩增艰难梭菌Tox 0和索氏梭菌的基因组DNA 中 CDB242HQ6 探针的 PCR 生长曲线：CDB203BZ/CDB202BZ (图 2A)、CDN211BZ/CDB214N (图 2B)和 CDB205BZ/CDB204BZ (图 2C)。
[0017]发明详沐 本文描述了用于检测样品中的艰难梭菌的实时测定。提供了用于检测艰难梭菌的引物 和探针，以及含有此类引物和探针的制品或试剂盒。与其他方法相比较用于检测艰难梭菌 的实时PCR增加的灵敏度，以及改善的实时PCR特征包括样品污染（containment)和扩增 产物的实时检测，使得这种技术用于在临床实验室中常规诊断艰难梭菌感染的实施可行。