发酵制备l-半胱氨酸以及所述氨基酸的衍生物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种发酵制备L-半胱氨酸以及所述氨基酸的衍生物L-胱氨酸和 2-甲基噻唑烷-2, 4-二羧酸的方法。
【背景技术】
[0002] L-胱氨酸是在两个L-半胱氨酸分子的氧化上形成的二硫化物。这个反应是可逆 的，这表示L-胱氨酸可以通过还原转化为L-半胱氨酸。
[0003] 2-甲基噻唑烷-2, 4-二羧酸（噻唑烷）是L-半胱氨酸和丙酮酸的缩合产物，其在 纯化学反应中形成（US5972663A)。这个反应同样是可逆的。因此，噻唑烷可以在升高的温 度下例如在酸中分解为其起始组分。
[0004] 氨基酸L-半胱氨酸具有经济重要性。例如，其用作食品添加剂（特别是在烘培剂 工业中），用作化妆品的原料，并且还用作制备药物活性成分（特别是N-乙酰半胱氨酸和 S-羧甲基半胱氨酸）的原材料。
[0005] 在所有生物体中，L-半胱氨酸在硫代谢中处于关键位置，并且用于蛋白、谷胱甘 肽、生物素、硫辛酸、甲硫氨酸和其他含硫代谢物的合成。此外，L-半胱氨酸用作生物合成 辅酶A的前体。L-半胱氨酸的生物合成已在细菌，特别是肠细菌中详细研宄，并且广泛描述 于 Kredich (1996,Biosynthesis of cysteine, p. 514-527. In F. C. Neidhardt, R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H. E. Umbarger(ed.), Escherichia coli and Salmonella:cellular and molecular biology，2nd ed. ASM Press，Washington，D.C)〇
[0006] 来自L-半胱氨酸生物合成中的中心代谢的一个重要前体是糖酵解的中间体3-磷 酸甘油酸。因此认为L-半胱氨酸与L-丝氨酸和甘氨酸一起是磷酸甘油酸家族的一部 分。相比之下，蛋白原氨基酸L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸和L-苏氨酸属于草酰乙酸家族， 因为共享的来自中心代谢的前体为柠檬酸循环中间体草酰乙酸。从碳源如葡萄糖继续，原 料流通过很大程度上互相独立的同化氨基酸代谢的这两个不同分支进行。但是，磷酸甘 油酸家族的中间体或终产物与草酰乙酸家族的单独生物合成步骤的某些相互作用是已知 的。例如，已描述催化L-天冬氨酸半醛还原为L-高丝氨酸的thrA基因产物高丝氨酸脱 氢酶I不仅可以受到L-丝氨酸抑制，还可以受到L-半胱氨酸抑制（Hama et al.，1991，J. Biochem. 109, 604-8 ;Datta, 1967, Biochemistry 58, 635-41)。此外，已知同化苏氛酸脱 氨酶 IlvA 受到 L-半胱氨酸抑制（Harris, 1981，J.Bacteriol. 145, 1031-35)。此外，与 L-苏氨酸类似地，L-丝氨酸可以用作IlvA基因产物的底物（Rasko et al.，1971，Eur. J. Biochem. 21，424-27) 〇
[0007] 虽然在各种专利中描述在磷酸甘油酸家族的氨基酸的发酵制备中可以将L-异亮 氨酸添加至培养基中（EP1233067, EP1382684)，但是其中仅将L-异亮氨酸引用为各种可能 的添加物之一。然而，L-异亮氨酸可以对氨基酸制备具有有益效果这一事实并未得到任何 教导或明示。
[0008] 在Dassleretal. (2000,Mol.Microbiol. 36:1101-1112)中，描述了在磷酸甘油 酸家族的氨基酸的发酵制备中将氨基酸L-甲硫氨酸、L-异亮氨酸和L-亮氨酸添加至预培 养的培养基中（在每种情况下〇. 3g/l)。但是，并未将这些氨基酸添加至发酵罐中主培养的 培养基中。这里也没有预培养的氨基酸补充可以对半胱氨酸或乙酰丝氨酸的制备具有有益 效果的提示。
[0009] 除了通过从角质性材料如毛发、刚毛、角、蹄和羽毛提取，或者通过前体的酶促转 换来生物转化的L-半胱氨酸的经典制备，几年前，还开发了一种用于发酵制备L-半胱氨 酸的方法。关于通过微生物发酵制备L-半胱氨酸的现有技术描述于例如US6218168B1、 US5972663A、US20040038352A1、A2386539A1、US20090053778A1 和 US20090226984A1。这里 使用的细菌宿主生物为棒状杆菌属的菌株，还有肠杆菌科的代表如大肠杆菌（Escherichia coli)或菠萝泛菌（Pantoea ananatis) 〇
[0010] 除了通过突变和选择获得改良的L-半胱氨酸生产者的经典方法，还以靶向方式 对菌株进行遗传修饰以获得有效的L-半胱氨酸过度产生。
[0011] 因此，引入cysE等位基因，其编码具有减少的被L-半胱氨酸反馈抑制 的丝氨酸-〇-乙酰基转移酶，导致半胱氨酸生成增加（US6218168B1 ;Nakamori et al.，1998, Appl. Env. Microbiol. 64:1607-1611)。L-半胱氨酸的直接前体 〇-乙酰基-L-丝 氨酸的形成通过反馈-抗性CysE酶基本上与细胞的L-半胱氨酸水平互不相干。
[0012] 0-乙酰基-L-丝氨酸形成自L-丝氨酸和乙酰基-CoA。因此，为L-半胱氨酸制备 提供足量的L-丝氨酸非常重要。这可以通过引入serA等位基因来实现，所述serA等位基 因编码具有减少的被L-丝氨酸反馈抑制的3-磷酸甘油酸脱氢酶。结果，L-丝氨酸的前体 3-羟基丙酮酸的形成基本上与细胞的L-丝氨酸水平互不相干。这类SerA酶的实例描述于 EP0620853 和 US2005009162A2。
[0013] 此外，已知发酵中的L-半胱氨酸收率可以通过减弱或破坏编码L-半胱氨酸-降 解酶如色氨酸酶TnaA或者胱硫醚-0 -裂解酶MalY或MetC的基因来增加（EP1571223)。
[0014] 增加L-半胱氨酸转运出细胞是增加培养基中产物收率的进一步可能性。这可以通 过所谓的外排基因的过量表达来实现。这些基因编码介导向细胞外输出L-半胱氨酸的膜 结合蛋白。对于L-半胱氨酸的输出已描述各种外排基因（US5972663A，US20040038352A1)。
[0015] L-半胱氨酸向细胞外输出进入发酵培养基具有许多优点：
[0016] 1)L_半胱氨酸连续地从细胞内反应平衡退出，结果细胞中这种氨基酸的水平保持 很低，因此没有由于L-半胱氨酸的敏感酶的反馈抑制：
[0017] (1)L-半胱氨酸(细胞内）SL-半胱氨酸(培养基）
[0018] 2)在培养期间引入培养基的氧的存在下，分泌入培养基的L-半胱氨酸氧化为二 硫化物L-胱氨酸（US5972663A):
[0019] (2) 2L-半胱氨酸+ 1/2 02达L-胱氨酸+H20
[0020] 因为在中性pH下L-胱氨酸在水性溶液中的溶解度非常低，特别是与L-半胱氨酸 相比，所以二硫化物甚至在低浓度下沉淀出来，并且形成白色沉淀：
[0021] ⑶L-胱氨酸(溶解）SL-胱氨酸(沉淀）
[0022] 由于L-胱氨酸的沉淀，溶于培养基中的产物水平降低，结果还在每种情况下，（1) 和（2)的反应平衡转移至产物侧。
[0023] 3)当氨基酸可以直接获得自发酵培养基时，纯化产物的技术支出比产物在细胞内 积累且必须首先进行细胞消化时明显降低。
[0024] 在本发明的上下文中，表述"总半胱氨酸"组合L-半胱氨酸以及由其形成的化合 物L-胱氨酸和噻唑烷，它们在发酵期间形成并且在培养物上清和沉淀中积累。
[0025] 除了L-半胱氨酸生成菌株的遗传修饰，优化发酵方法，即培养细胞的类型和方式 也在开发高效制备方法中起着重要作用。
[0026] 在这种情况下，各种培养参数如碳源和能源的类型和剂量、温度、氧供应 (DE102011075656A1)、pH还有培养基的组成可以影响L-半胱氨酸的发酵制备中的产物收 率和/或产物谱。
[0027] 由于原材料和能源成本持续增加，所以不断需要增加L-半胱氨酸制备中的产物 收率，以便以这种方式提高方法的经济效率。
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