一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明属于人核酸体外检测技术领域，具体涉及一种人运动神经元基因拷贝数相 对定量检测方法及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 位于人5号染色体上的运动神经兀存活基因（Survival of Motor Neuron, SMN) 包括端粒端的运动神经元存活基因1 (SMNl)和着丝粒端的运动神经元存活基因2 (SMN2)， 二者均有8个外显子，分别为外显子1、外显子2a、外显子化W及外显子3 - 8。SMN1与 SMN2高度同源，仅相差5个核巧酸（内含子6;-45G - A，外显子7;+6C - T，内含子7: +100A - G和+214A - G，外显子8;+245G - A)。SMN蛋白正常表达与人脊髓前角a运动 神经元的功能密切相关。当缺失S^1N蛋白或S^1N蛋白功能异常时，将导致脊髓前角a运动 神经元功能退化，出现进行性、对称性肢体近端和躯干肌肉无力、萎缩，进而死亡，该一疾病 被称为脊髓性肌萎缩症（Spinal Mus州lar Atrophy, SMA)。目前的研究已表明，导致SMA 的主要原因为SMN1基因缺陷，而SMN2基因与SMA临床表现的轻重相关。原因是，SMN1基 因表达的蛋白是维持脊髓前角a运动神经元功能的主要蛋白，而SMN2基因所表达蛋白的 功能仅相当于SMN1基因所表达蛋白功能的约10%。SMA是一种常见的神经系统常染色体隐 性遗传病，群体发病率高达1:6 000 - 1:10 000,居神经系统致死性常染色体隐性遗传病 的第二位。最近的研究表明，S^1N的拷贝数可能还与散发性肌萎缩侧索硬化症的预后和表 型相关。因此，对人SMN基因拷贝数进行相对定量检测，无论是对临床相关疾病的辅助诊断 或是对新生儿SMA出生缺陷预防都是具有参考价值的指标之一。
[0003] 人细胞为二倍体细胞，正常人细胞中2条染色体上各有一个正常的SMN1基因，即 每个正常细胞有2个拷贝的SMN1基因，携带者由于1条染色体上的SMN1基因突变导致功 能缺失则仅有1个拷贝的SMN1基因，SMA患者则无正常的SMN1基因，即为0拷贝。SMN2基 因的拷贝数对SMA的疾病表型有重要影响，SMN2拷贝数越多，SMA的临床表现越轻，患者存 活时间也越长。研突变表明，正常人每细胞中的SMN2的拷贝数可W从0-3个拷贝不等，多 数为1个拷贝或2个拷贝。
[0004] 在导致SMA的SMN1基因突变中，最常见的是SMN1基因第7和/或第8外显子的 缺失，该两个位点的突变占SMN1基因突变谱的95% W上，其它的突变类型多为点突变或小 片段的缺失或重复，其中在欧美人群中发现S^1N1基因外显子6的815 (A〉0错意突变 (即 Y272CX768-778 dup[TGCTGATGCIT]移码突变（即 Ubp-DUP)及外显子 3 的 399-402 del [AGAG]移码突变（即4bp-DEL)是最为常见的H个热点突变。在不同人群中对SMN1基 因突变进行的研究发现，在全球范围内，SMN1基因携带者频率为1 ;40 - 1 ;60。
[0005] 然而，目前临床上尚无方便的可对SMN1和SMN2基因拷贝数相对定量的检测方法。 临床上对SM的辅助分子检测，目前常用的是聚合酶链式反应一限制性片段长度多态性 法，即PCR-RFLP法(李秀玲等，中国妇幼保健，2011,26:2220-2223)。该一方法仅可对S^1N1 基因第7外显子、第8外显子缺失纯合（即0拷贝）的SMA病例进行定性检测，无法对S^1N1 基因缺失突变携带者进行检测。另一常用的方法是多重连接探针扩增技术，即MPLA法， (Passon N, et al. Mol Cell Probes. 2010，24(5) : 310-314)。目前，荷兰 MRC 公司已推 出仅用于科学研究的基于MLPA技术的SMA检测试剂。其它的方法还包括变性高效液相色 谱法，即 DHPLC 法（SuYN, etal. PLoSOne. 2011，6(2):el7067)〇 无论是 DHPLC 法还是 MLPA法，虽然可W对SMNl和SMN2基因第7外显子和第8外显子缺失携带者进行检测，但该 些方法均需要在PCR反应结束后，开管对PCR产物进行后处理，在操作过程中易发生实验室 污染，且费时、费力，无法实现大通量的批量检测。另外，无论是DHPLC法还是MLPA法，对于 SMN1和SMN2基因第7外显子和第8外显子的拷贝数定量只是在PCR反应终点半定量，其 结果判断更多的是依据经验而无法形成标准化的结果判定方法。近年来，已有学者在研究 基于实时英光定量聚合酶链式反应技术的SMA检测方法，即Real-Time PCR法（曾聽孟等， 发明专利申请；201310509147. 9 ;江雨等，中华医学遗传学杂志，2014,31(2) :180-184)。 Real-time PCR的方法可W有效地避免PCR-RFLP、DHPLC、MLPA等技术的缺陷。然而对目前 采用Real-Time PCR技术进行SMA检测的一些文献进行分析发现，该些技术均是基于S^1N1 与SMN2基因间的有限核巧酸差异(外显子7与外显子8各有一个核巧酸的差异)，采用传统 的扩增阻抗原理设计相应的引物与探针。W第7外显子为例，即将SMN1基因与SMN2的差 异碱基置于PCR引物3'端最后一位（SMN1第7外显子为C, SMN2第7外显子为T),而检测 探针采用SMN1与SMN2公用探针。然而，研究表明，该样的设计并足W有效区别SMN1第7 外显子和SMN2第7外显子。从而使对SMN1或SMN2基因拷贝数的相对定量出现偏差，影响 其结果的临床参考价值。Rea^Time PCR法的另一设计策略是，依据SMN1与SMN2的差异 碱基巧日第7外显子的C和T、第8外显子的G和A)，在差异碱基位置设计特异性的探针，但 该一设计无法避免的是SMN1与SMN2的PCR扩增引物将是公用的。大样本的研究表明，在 携带者群体中，SMN2基因拷贝数可多达4个W上，对于只有1个拷贝SMN1的携带者而言， 当SMN1与SMN2采用公用引物进行扩增时，将无法避免多拷贝SMN2基因优势扩增对单拷贝 SMN1基因的影响（因为此时二者的PCR引物相同)，同样会导致相对定量结果的偏差。另外， 该些技术所关注的也仅是SMN1外显子7和外显子8的缺失突变，而未能对SMN1基因外显 子6的Y272C、Ubp-DUP及外显子3的4bp-呢L等常见热点突变进行检测。
[0006] 因此，现有技术方法的可靠性无法满足对于人运动神经元基因拷贝数相对定量的 需要，迫切需要一种可靠的、可对SMN1基因和SMN2基因第7、第8外显子拷贝数进行相对定 量的检测方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的就是针对目前人运动神经元基因拷贝数定量检测方法存在的问题 与不足，提供一种检测快速、简便，检测结果可靠的人运动神经元基因拷贝数相对定量检测 方法及检测试剂盒。
[0008] 本发明提供的人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及试剂盒，是针对人运 动神经元基因(包括SMN1和SMN2基因)第7、第8外显子拷贝数进行相对定量检测，并同时 对SMN1第6外显子Y272C、Ubp-DUP和第3外显子4bp-呢L H个热点突变的基因型进行定 性检测。本发明设计巧妙，采用闭管检测，避免样本污染，同时可有效避免现有扩增阻方法 中SMN1与SMN2高度同源性导致的相互干扰，检测快速、简便，相对定量检测结果可靠，适于 大规模推广应用。
[0009] 本发明提供的人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法，是采用四个PCR反应 分别对SMN1基因第7和第8外显子、SMN2基因第7和第8外显子进行拷贝数相对定量检 巧1|，并采用第五PCR反应对SMN1第6和第3外显子上H个热点突变进行定性检测，其中： 1、第一 PCR反应，是针对SMN1基因第7外显子的相对定量检测PCR反应，采用如下引 物与探针： 公用上游引物P1 (为SEQ ID No. 1所示核巧酸序列)、公用引物P2 (为SEQ ID No. 2所 示核巧酸序列XRPP40上游引物P3 (为SEQ ID No. 3所示核巧酸序列XRPP40下游引物P4 (为569 10齡.4所示核巧酸序列)、3??40检测探针？5(为569 10齡.5所示核巧酸序列)、 SMN1第7外显子上游引物阳7-1F (为SEQ ID No. 6所示核巧酸序列)、SMN1第7外显子下 游引物阳7-1R (为SEQ ID No. 7所示核巧酸序列）、SMN1第7外显子检测探针阳7-1D (为 SEQ ID No. 8所示核巧酸序列XSMN2第7外显子封闭探针阳7-2A (为SEQ ID No. 9所示核 巧酸序列)。
[0010] 其中，P1、P2、P3、P4、P5、阳7-1F、PE7-1R、阳7-1D、阳7-2A 工作浓度范围依次为： 300 - 600nmol/L、300 - 600nmol/L、20 - 60nmol/L、20 - 60nmol/L、100 - 200nmol/L、30 一 60nmol/L、30 - 60nmol/L、100 - 200nmol/L、100 - 400nmol/L。
[0011] 2、第二PCR反应，