一种检测线粒体dna鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测线粒体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，属于细胞质雄性不育检测技术领域。
【背景技术】
[0002]植物界中细胞质雄性不育非常常见，利用雄性不育进行育种是国际制种业的主要趋势，该技术可免去人工去雄，提高杂交种子的纯度和扩大遗传距离而增加产量；细胞质雄性不育主要与线粒体DNA重排相关，至今没有两个细胞质雄性不育突变被发现是完全相同。水稻、玉米和小麦等植物已经建立了细胞质雄性不育系和可育之间的细胞质分子标记，能很快的区分不育系和可育材料；而对辣椒雄性不育系遗传物质的研宄主要集中在细胞核方面，细胞质方面很少见报道，能直接用于鉴定辣椒细胞质雄性不育系的细胞质分子标记更少，因而无法简单快速的区分细胞质雄性不育系，这限制了辣椒杂交育种的发展。
【发明内容】
[0003](一 )要解决的技术问题
[0004]为解决上述问题，本发明提出了一种检测线粒体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，通过检测线粒体DNA确定辣椒细胞质雄性不育系的特征位点，进行细胞质雄性不育系鉴定；其检测过程比较简单，检测结果准确。
[0005]( 二)技术方案
[0006]本发明的检测线粒体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法；所述方法包括以下步骤:
[0007]第一步，提取总DNA，采取CTAB法提取待测辣椒叶片中的总DNA ；
[0008]第二步，用线粒体引物Ml和M2对上述的总DNA进行PCR扩增；
[0009]第三步，对所得PCR扩增产物进行克隆测序；
[0010]第四步，将所得碱基序列与可育辣椒序列对比，对比辣椒细胞质雄性不育线粒体DNA分子指纹，确定辣椒细胞质雄性不育系的特征位点，进行细胞质雄性不育系鉴定。
[0011]进一步地，所述线粒体引物Ml的正向序列为:
[0012]5-TGGATTACCTCTTCCAACT-3，
[0013]所述线粒体引物Ml的反向序列为:
[0014]5-ATCACTATATGGAACCAAC-3 ；
[0015]所述线粒体引物M2的正向序列为:
[0016]5-CGATCTTAGTTGGAGGAG-3，
[0017]所述线粒体引物M2的反向序列为:
[0018]5-CCAACGGAAACCTAGTTA-3。
[0019]进一步地，所述辣椒细胞质雄性不育线粒体DNA分子指纹:
[0020]Ml片段:辣椒细胞质雄性不育线粒体DNA在位点8、11、22_23、25、29、831、867和879分别为T、C、AT、Α、C、G、T和C，而可育辣椒在这些位点分别为C、A、CG、C、C、T、A和T ;
[0021]M2片段:辣椒细胞质雄性不育线粒体DNA在位点11-12、15-18、22_26、34_35、38-42,47-58 和 63-56 为 GG、GATA, GATAC, GA、CTGGT, CTAGCTTTGCCG 和 GCC，而可育辣椒在这些位点分别为 TA、ATCG、ATAGA、TT、TAACC、GGTATCACTGGT 和 AGT。
[0022](三)有益效果
[0023]与现有技术相比，本发明检测线粒体DNA鉴定辣椒细胞质不育系的方法，在鉴定辣椒细胞质不育系时只需对线粒体引物Ml和M2的PCR扩增产物进行克隆测序，然后进行比较即可简单、高效和准确的鉴定出辣椒细胞质雄性不育系。
【附图说明】
[0024]图1是本发明实施例1的3个细胞质雄性不育系和相应的保持系供试材料表。
[0025]图2是本发明实施例1的线粒体引物的列表。
[0026]图3是本发明实施例1的线粒体信息位点列表。
【具体实施方式】
[0027]实施例1:
[0028]如图1至图3所示，本发明以3份常规辣椒品种为对照，对3个细胞质雄性不育系和相应的保持系进行线粒体Ml和M2片段的扩增序列，并运用相关软件分析，建立辣椒细胞质雄性不育系的线粒体DNA分子指纹。
[0029]其具体步骤如下:
[0030]第一步，提取总DNA，采取CTAB法提取待测辣椒叶片中的总DNA ；
[0031]第二步，用线粒体引物Ml和M2对上述的总DNA进行PCR扩增；
[0032]第三步，对所得PCR扩增产物进行克隆测序；
[0033]第四步，将所得碱基序列与可育辣椒序列对比，对比辣椒细胞质雄性不育线粒体DNA分子指纹，确定辣椒细胞质雄性不育系的特征位点，进行细胞质雄性不育系鉴定。
[0034]其中，所述线粒体引物Ml的正向序列为:
[0035]5-TGGATTACCTCTTCCAACT-3，
[0036]所述线粒体引物Ml的反向序列为:
[0037]5-ATCACTATATGGAACCAAC-3 ；
[0038]所述线粒体引物M2的正向序列为:
[0039]5-CGATCTTAGTTGGAGGAG-3,
[0040]所述线粒体引物M2的反向序列为:
[0041]5-CCAACGGAAACCTAGTTA-3。
[0042]上述辣椒细胞质雄性不育线粒体DNA分子指纹中，
[0043]不育辣椒:在Ml 片段的位点 8、11、22-23、25、29、831、867 和 879 分别为 T、C、AT、A、C、G、T 和 C，在 M2 片段的位点 11-12、15-18、22-26、34-35、38-42、47-58 和 63-56 分别为GG、GATA、GATAC、GA、CTGGT、CTAGCTTTGCCG 和 GCC ；
[0044]可育辣椒:在Ml片段的位点8、11、22-23、25、29、831、867和879分别为为(:、4、〇6、C、C、T、A 和 T，在 M2 片段的位点 11-12、15-18、22-26、34-35、38-42、47-58 和 63-56 分别为TA、ATCG、ATAGA、TT、TAACC、GGTATCACTGGT 和 AGT。
[0045]其检测结果为:9704A、PBC362A和Co4761A为细胞质雄性不育系。
[0046]上面所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定。在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入到本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。
【主权项】
1.一种检测线粒体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，其特征在于:所述方法包括以下步骤: 第一步，提取总DNA，采取CTAB法提取待测辣椒叶片中的总DNA ； 第二步，用线粒体引物Ml和M2对上述的总DNA进行PCR扩增； 第三步，对所得PCR扩增产物进行克隆测序； 第四步，将所得碱基序列与可育辣椒序列对比，对比辣椒细胞质雄性不育线粒体DNA分子指纹，确定辣椒细胞质雄性不育系的特征位点，进行细胞质雄性不育系鉴定。
2.根据权利要求1所述检测线粒体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，其特征在于: 所述线粒体引物Ml的正向序列为:5-TGGATTACCTCTTCCAACT-3， 所述线粒体引物Ml的反向序列为:5-ATCACTATATGGAACCAAC-3 ； 所述线粒体引物M2的正向序列为:5-CGATCTTAGTTGGAGGAG-3， 所述线粒体引物M2的反向序列为:5-CCAACGGAAACCTAGTTA-3。
3.根据权利要求1或2所述检测线粒体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，所述辣椒细胞质雄性不育线粒体DNA分子指纹: Ml片段:辣椒细胞质雄性不育线粒体DNA在位点8、11、22-23、25、29、831、867和879分别为T、C、AT、A、C、G、T和C，而可育辣椒在这些位点分别为C、A、CG、C、C、T、A和T ; M2片段:辣椒细胞质雄性不育线粒体DNA在位点11-12、15-18、22-26、34-35、38-42、47-58 和 63-56 为 GG、GATA, GATAC, GA、CTGGT, CTAGCTTTGCCG 和 GCC，而可育辣椒在这些位点分别为 TA、ATCG、ATAGA、TT、TAACC、GGTATCACTGGT 和 AGT。
【专利摘要】本发明公开了一种检测线粒体DNA鉴定辣椒细胞质雄性不育系的方法，以辣椒叶片为材料，提取叶片中的总DNA，用线粒体引物M1和M2进行PCR扩增，对扩增产物进行克隆测序，再与辣椒细胞质雄性不育的线粒体DNA分子指纹进行比较即可简单、高效和准确的鉴定出辣椒细胞质雄性不育系。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104630347
【申请号】CN201510006722
【发明人】欧立军, 杨博智, 危革, 刘周斌, 邹学校, 戴雄泽, 张竹青
【申请人】湖南省蔬菜研究所, 欧立军
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月7日