一种丙型肝炎病毒ires元件所对应的特定翻译起始序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种丙型肝炎病毒IRES元件所对应的特定翻译起始序列。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎病毒（Ifepatitis C virus, HCV)是黄病毒科的成员，是造成慢性丙型肝 炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一。全球范围内大约有2亿人感染HCV，感染人口约占全 球人口的2~3%。HCV严重地威胁人类健康和影响人类生活质量，但是我们对HCV的致病 机制W及病理发生过程还缺乏全面深入的了解，还没有研制出对HCV有效的保护性疫苗 和治疗方法。
[0003] HCV是黄病毒科(Flaviviridae)成员，是直径约有50皿的球形颗粒。病毒有一 脂质包膜，结合着宿主来源的脂质或免疫球蛋白。包膜内部是密度较高的核也颗粒，由核也 蛋白和病毒核酸相结合构成。HCV的基因组是一单股正链RNA分子。HCV在被感染宿主体 内的主要寄生地是肝脏，其病毒的浓度是外周循环血中的120倍。HCV有严格的宿主限制 性，迄今已证实的可感染宿主只有人类和黑猩猩。
[0004] 丙型肝炎病毒的基因组约为9600bp左右，包括一个大的约为9036bp的开放阅读 框（0RF)，和两侧的非编码区。HCV的基因组虽小，但也可W分为许多不同功能的基因功能 区，根据蛋白的功能不同，可W将HCV的10种蛋白分为结构蛋白和非结构蛋白两大类。该 些蛋白在HCV生活史、宿主细胞的信号传导、调亡和物质代谢等过程中发挥着各自的重要 作用。
[0005] RNA病毒基因表达效率的研究结果显示，RNA病毒基因表达主要由两种翻译起始 机制进行调控；（1)依赖5'端甲基化帽状结构（GpppmG-)介导核糖体对病毒基因进行 翻译起始；（2)非依赖5'端甲基化帽状结构，而是依赖内部核糖体进入位点（Internal ribosomal entry site, IRE巧介导核糖体对病毒基因进行翻译起始。IRES是一种具有介 导翻译起始功能的RNA元件，依照IRES结构和功能的差异性，IRES元件被划分为四大类群， 即I型（WEV71为代表)，11型（WFMDV为代表)，111型（WHCV为代表）和IV (W CrPV为 代表)。IRES元件对病毒基因的高效的翻译表达为正链RNA病毒在宿主体内快速增殖扩大 种群规模具有重要意义，从而为丙型肝炎的预防和控制提供理论依据。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种丙型肝炎病毒IRES元件所对应的特定翻译起始序列，该些序列 可W精确地控制丙型肝炎病毒IRES元件所对应的特定翻译起始序列对下游蛋白的表达。
[0007] 本发明申请人在对III型IRES元件进行二级结构和和生物化学方面的研究中发 现，III型与I型和II型IRES元件同样都具有通过其自身核巧酸序列所形成的特征性空 间结构来诱导翻译起始复合物的构象发生改变，影响核糖体对于翻译起始序列的敏感性识 别和其下游序列对核糖体内部mRNA结合裂隙的进入、定位和固定，从而加强下游蛋白质合 成和表达，但IRES元件介导核糖体所激活的翻译起始事件是否也需要遵守核糖体倾向于 选择具有优势核巧酸环境的甲硫氨酸密码子（AUG)作为真正的翻译起始密码子，是本申 请人需要进一步研究的问题。
[0008] 本申请人经实验研究发现，丙型肝炎病毒IRES元件所对应的特定翻译起始序列 为： 序列 1 :-3ACCATG+4GTG ; 序列 2 ;-3ACCATG+4TTG ; 序列 3 :-3ACCATG+4CTG ; 序列 4 ;-3ACCATG+4ATG ; 序列 5 ;-3TCCATG+4GTG ; 序列 6 ;-3TCCATG+4CTG ; 序列 7 ;-3TCCATG+4TTG ; 序列 8 ;-3TCCATG+4ATG ; 序列 9 ;-3CCCATG+4GTG ; 序列 10 ;-3CCCATG+4ATG ; 序列 11 ;-3CCCATG+4TTG ; 序列 12 ;-3CCCATG+4CTG ; 序列 13 ;-3GCCATG+4GTG ; 序列 14 ;-3GCCATG+4CTG ; 序列 15 ;-3GCCATG+4TTG ; 序列 16 ;-3GCCATG+4ATG。
[0009] 本申请人发现上述丙型肝炎病毒IRES元件所对应的特定翻译起始序列能够调控 下游序列的蛋白表达。
[0010] 本申请人还发现当丙型肝炎病毒IRES元件所对应的特定翻译起始序列 为-3ACCATG+4GTG时，下游序列蛋白表达量最大。
[0011] 本申请人通过定点突变技术将翻译起始序列区的+4位核巧酸分别替换为四种不 同的核巧酸。将含有同种IRES元件而翻译起始序列区+4位不同的表达质粒导入CH0细胞 进行瞬时表达。通过流式细胞仪将表达EGFP蛋白的发光细胞进行分选并计数。而后，利用 蛋白质印记技术，将筛选出的等量CH0细胞进行CAT表达产物和EGFP表达产物的检测，通 过灰度计算测定IRES元件介导核糖体对翻译起始区+4位和-3位特定核巧酸识别敏感性 差异而导致IRES元件下游EGFP基因表达水平的差异性。经实验得到：当翻译起始区的序 列为-3ACCATG+4GTG时，下游EGFP基因的表达效率是所有16中翻译起始序列中最高的。
【附图说明】
[0012] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为含有HCV IRES元件的双报告表达载体构建示意图，从左至右依次为kozak序列 (ACC ATG G,该是一个可W明显提局真核细胞基因表达的翻译起始序列），CAT报告基因， IRES元件、翻译起始序列、EGFG报告基因； 图2为CAT和EGFP蛋白编码基因的PCR扩增产物电泳图； 图3为16种含有HCV IRES元件的双报告基因表达载体中目的基因的双酶切鉴定结果， 其中，M表示核酸Marker ;序号1-序号16为含有HCV IRES元件的双报告基因的真核表达 质粒的双酶切鉴定结果； 图4为16种含有HCV IRES元件的双报告基因特定翻译起始区-3位和+4位突变测序 图谱； 图5为16种含有HCV IRES元件的双报告基因表达质粒在CHO细胞中表达CAT蛋白的 蛋白质印记结果； 图6为16种含有HCV IRES元件的双报告基因表达质粒在CHO细胞中表达EGFP蛋白 的蛋白质印记结果； 图7为16种翻译起始序列在HCV IRES元件的介导下对EGFP基因表达水平的影响效 果对比图。
【具体实施方式】
[0013] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0014] 氯霉素己醜转移酶基因（CAT)购自；苏州金唯智生物科技有限公司； 增强型绿色英光蛋白巧GFP)购自：苏州金唯智生物科技有限公司； 实施例1
【主权项】
1. 一种丙型肝炎病毒IRES元件所对应的特定翻译起始序列，其特征在于：所述特定翻 译起始序列为： 序列 I :-3ACCATG+4GTG ; 序列 2 :-3ACCATG+4TTG ; 序列 3 :-3ACCATG+4CTG ; 序列 4 :-3ACCATG+4ATG ; 序列 5 :-3TCCATG+4GTG ; 序列 6 :-3TCCATG+4CTG ; 序列 7 :-3TCCATG+4TTG ; 序列 8 :-3TCCATG+4ATG ; 序列 9 :-3CCCATG+4GTG ; 序列 10 :-3CCCATG+4ATG ; 序列 11 :-3CCCATG+4TTG ; 序列 12 :-3CCCATG+4CTG ; 序列 13 :-3GCCATG+4GTG ; 序列 14 :-3GCCATG+4CTG ; 序列 15 :-3GCCATG+4TTG ; 序列 16 :-3GCCATG+4ATG。
2. 权利要求1所述的丙型肝炎病毒IRES元件所对应的特定翻译起始序列在对下游序 列蛋白表达调控中的作用。
3. 根据权利要求2所述的作用，其特征在于：当丙型肝炎病毒IRES元件所对应的特定 翻译起始序列为-3ACCATG+4GTG时，下游序列蛋白表达量最大。
【专利摘要】本发明提供一种丙型肝炎病毒IRES元件所对应的特定翻译起始序列，本发明还提供上述丙型肝炎病毒IRES元件所对应的特定翻译起始序列在对下游序列蛋白表达调控中的作用。IRES元件介导核糖体对翻译起始区+4位和-3位特定核苷酸识别敏感性差异而导致IRES元件下游EGFP基因表达水平的差异。经实验得到，当翻译起始区的序列为-3ACCATG+4GTG时，下游EGFP基因的表达效率是所有16中翻译起始序列中最高的。
【IPC分类】C12N15-11, C12N15-63
【公开号】CN104630212
【申请号】CN201410689438
【发明人】刘永生, 周建华, 李学瑞, 丁耀忠
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2014年11月26日