用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微加工技术与组织工程技术领域，尤其涉及用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片及方法。
【背景技术】
[0002]近年来，随着我国人口老年化程度的不断加剧，同时由于遗传因素及环境因素的影响，中枢神经系统疾病逐渐成为临床医学专家们需要面对的一项重要挑战。长期以来，基于对神经退行性病变机理的研宄，人们一直以神经细胞为作用对象，以单一靶点作为研宄目标，试图以神经保护的治疗策略来阻止神经退行性疾病的发生发展。然而，针对神经系统的疾病，单一的细胞内途径或细胞类型是远远不够的，有效的治疗策略必须超越单一的治疗革巴点。神经血管单元(neurovascular unit, NVU)提供了一个大脑发生退行病变后更为全面的整合的治疗靶点。此概念的提出旨在强调神经元、神经胶质细胞和血管内皮间相互联系及相互影响的重要性，并将三者放在一个微小的三维环境中研宄，为整体研宄神经元损伤及保护机制、寻找临床治疗的新靶点提供依据。
[0003]构建一种与载体相似的、由“神经血管单元”主要结构和功能细胞组成的体外共培养模型，用于脑神经血管疾病的病理生理研宄及其防治药物的筛选，具有极为重要的意义。目前国内外有利用transwell培养小室为媒介建立体外“神经血管单元”模型的研宄报道，也有不少学者通过脑片培养来体外模拟神经血管单元。但是利用新兴的微流控芯片(microfludic chip)来模拟神经血管单元尚不多见，且其侧重点多用于构建一种新型的体外血脑屏障(Blood Brain Barrier, BBB)来用于中枢神经系统药物的筛选，并不是神经血管单元模型。因为其未能充分而科学的理解脑中神经血管相互联系与影响之网络，只是建立起神经血管单元中星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞联系而忽略了星形胶质细胞与神经元的直接联系，或者是建立了星形胶质细胞与神经元直接联系而忽略了其同样也与脑微血管内皮细胞的直接接触关系。目前体外建立神经血管单元细胞模型多使用以transwell培养小室为媒介，此模型虽然结合原代神经细胞培养技术及大鼠脑微血管内皮细胞培养技术，将神经元、星形胶质细胞及脑微血管内皮细胞培养在一个立体的三维空间体系中，但是由于transwell小室结构构造的限制，以上三种细胞只能实现其中立体空间上的两种直接接触联系。与大脑中星形胶质细胞作为桥梁共同连接其他两种要素细胞的真实构架(神经元一星形胶质细胞一脑微血管内皮细胞)仍有较大差距。故目前亟待一种新的装置来实现立体或者平面空间上神经血管单元中星形胶质细胞作为中间桥梁连接神经元和微血管内皮细胞。
[0004]微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研宄等特点而成为新一代细胞研宄的重要平台。它对于实验结果能够实时追踪和原位观察，给研宄脑疾病尤其是脑血管疾病的基础研宄提供一个稳定科学的平台。2011年Devi Majumdar和他的同事实现了大鼠海马神经元和星形胶质细胞在微流控芯片上的共培养生长。Ross Booth等利用多层次微流控芯片装置、脑微血管内皮细胞及星形胶质细胞细胞系在体外模拟血脑屏障(BBB)。AKHAchyuta等在微流控芯片立体空间上模拟神经血管单元，其中上池是脑微血管内皮细胞细胞层，下池是星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞的混合培养，但该模型存在的较大缺陷是未实现星形胶质细胞的足突直接连接脑微血管内皮细胞层。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提出用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片及方法，能够非常简单地实现星形胶质细胞的足突直接连接脑微血管内皮细胞层，同时又能与神经元细胞层建立联系，实现了单个星形胶质细胞的足突即连接脑微血管内皮细胞同时又连接神经元胞体。
[0006]为达此目的，本发明采用以下技术方案:
[0007]一种用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片，包括:位于中间的第一流道，位于第一流道两侧且呈回形弯曲的对称结构的第二流道和第三流道，以及用于连接第一流道与第二流道、第一流道与第三流道的细流道；
[0008]所述第一流道，用于接种神经血管单元中的星形胶质细胞；
[0009]所述第二流道，用于接种神经血管单元中的神经元；
[0010]所述第三流道，用于接种神经血管单元中的脑微血管内皮细胞。
[0011]其中，所述第一流道、第二流道、第三流道的池深均为40-60 μ m，所述细流道高度为 5-10 μm。
[0012]一种用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片的制造方法，包括:
[0013]步骤1、在衬底材料上通过光刻技术制作细流道；
[0014]步骤2、在衬底材料上通过光刻技术制作第一流道、第二流道及第三流道；
[0015]步骤3、使用PDMS倒模复制出光刻的模板结构；
[0016]步骤4、与玻璃基底封接以形成封闭的流道，完成微流控芯片结构的制造。
[0017]其中，在步骤I之前，还包括:选择衬底材料；
[0018]所述步骤1、在衬底材料上通过光刻技术制作细流道，包括:
[0019]匀胶，将光刻胶滴在衬底材料上，利用匀胶机完成涂胶；
[0020]软烘，对涂胶后的衬底材料进行两级加热；
[0021]光刻，利用光刻机及第一掩膜板制作出细流道光刻胶结构。
[0022]其中，所述光刻胶的型号为SU8-3005，滴在衬底材料上的光刻胶的量为0.5-1.5mL，所述匀胶机的转速为2500-3500rmp，所述匀胶机的转动时间为20_60s，涂覆光刻胶的厚度为5-10 ym;
[0023]所述两级加热，包括:60-70°C温度下烘烤1-2分钟，90-100°C温度下烘烤2_4分钟。
[0024]其中，所述滴在衬底材料上的光刻胶的量为lmL，所述匀胶机的转速为3000rmp，所述匀胶机的转动时间为30s ；
[0025]所述两级加热，包括65°C温度下烘烤I分钟，95°C温度下烘烤3分钟。
[0026]其中，所述步骤2、在衬底材料上通过光刻技术制作第一流道、第二流道及第三流道，包括:
[0027]匀胶，将光刻胶滴在细流道光刻胶结构上，利用匀胶机完成涂胶；
[0028]软烘，对涂胶后的衬底材料进行两级加热；
[0029]光刻，利用光刻机及第二掩膜板制作出第一流道、第二流道及第三流道的光刻胶结构。
[0030]其中，所述步骤2中的所述光刻胶的型号为SU8-3050，所述匀胶机的转速为2500-3500rmp，所述匀胶机的转动时间为20_60s，涂覆光刻胶的厚度为40-60 μπι ;
[0031]所述步骤2中的所述两级加热，包括:60-70°C温度下烘烤1-2分钟，90-100°C温度下烘烤2-4分钟。
[0032]其中，所述步骤2中的所述匀胶机的转速为3000rmp，所述匀胶机的转动时间为30s，所述两级加热，包括65°C温度下烘烤I分钟，95°C温度下烘烤3分钟。
[0033]其中，所述步骤2还包括:
[0034]坚膜烘焙，对细流道光刻胶结构以及第一流道、第二流道及第三流道的光刻胶结构进行两级加热；
[0035]显影，利用显影液将细流道光刻胶结构以及第一流道、第二流道及第三流道的光刻胶结构中的没有固化的光刻胶去除；
[0036]最后坚膜。
[0037]其中，所述坚膜烘焙中的两级加热，包括:60-70°C温度下烘烤1-2分钟，90_100°C温度下烘烤2-4分钟；
[0038]所述显影液为SU8显影液；
[0039]所述最后坚膜的温度为130_170°C。
[0040]其中，所述坚膜烘焙中的两级加热，包括:65°C温度下烘烤I分钟，95°C温度下烘烤3分钟；
[0041]所述最后坚膜的温度为150°C。
[0042]一种使用上述所述的用于建立三类细胞体外共培养模型的微流控芯片培养细胞方法，包括:
[0043]提取、纯化神经元、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞；
[0044]在微流控芯片结构的第一流道接种星形胶质细胞后，再在第二流道接种神经元，记录二者生长状态，并用TJUl标记神经元和用GFAP标记星形胶质细胞，观察二者连接状态；
[0045]在微流控芯片结构的第三流道接种脑微血管内皮细胞后，再在第一流道接种星形胶质细胞，记录二者生长状态，并用GFAP标记星形胶质细胞和vWF标记脑微血管内皮细胞，观察二者连接状态；
[0046]在微流控芯片结构的第一流道接种星形胶质细胞后，再在第三流道接种脑微血管内皮细胞，最后在第二流道接种神经元，调整培养条件，记录三者生长状态，并用GFAP标记星形胶质细胞、vWF标记脑微血管内皮细胞和TJUl标记神经元，观察三者连接状态。
[0047]其中，