一种肝细胞生长因子受体关键结构域融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于融合蛋白领域，特别涉及一种肝细胞生长因子受体关键结构域融合蛋 白及其应用。
【背景技术】
[0002] C_Met是肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor, HGF)已知的惟一受体，也 是一类具有自身磷酸化活性的跨膜受体，在多种恶性肿瘤的发生发展中具有重要作用。临 床研究发现，C-Met的过量表达可见于在我国发病率较高的肺癌、肝癌、大肠癌、乳腺癌中， 并与肿瘤恶性化程度、转移及预后呈正相关。C-Met主要包括三个功能不同的结构域：胞外 区、跨膜区和胞内区。C-Met胞外区（Extracellular domain, ED)包含一个信号素轴向蛋 白样的结构域、一个富含Cys的PSI区域以及四个免疫球蛋白-plexin-转录因子同源结 构组成的IPT1-4结构域。胞内区则包含一个近膜区、一个酪氨酸激酶区和一个C-末端序 列。ED作为配体识别部位识别并结合HGF，对后续发生的一系列生物调节效应具有重要作 用。近年来研究还发现，C-Met胞外区中的IPT3-4结构域也是C-Met与HGF结合的关键结 构域。HGF与ED结合使其构象发生改变，磷酸化激活胞内多条信号转导途径，促进肿瘤细胞 的增殖、迁徙和血管生成，最终导致恶性肿瘤细胞侵入正常组织，穿透脏器组织层，最终扩 散至全身。一旦肿瘤细胞中异常活化的HGF/C-Met信号通路被阻断，肿瘤细胞就会出现细 胞增殖减缓、成瘤性降低、侵袭能力下降等一系列变化。阻断HGF/C-Met信号通路的酪氨酸 激酶抑制剂cabozantinib已于2012年获FDA批准用于晚期甲状腺髓样癌的治疗。目前， 还没有FDA批准的抗C-Met的中和抗体药物。
[0003] 中和性抗体因其特异性强、副作用小等特点，在多种肿瘤治疗中发挥重要作用。中 和性抗体不仅能与相应抗原受体特异性结合，还能有效中和配体对受体的作用，具有发展 成为治疗性抗体药物的潜力，在人类疾病治疗中发挥关键作用。如经FDA批准治疗乳腺癌 的中和抗体类药物曲妥珠单抗（trastuzumab)能特异性与人表皮生长因子受体2结合，阻 断配体介导的信号转导，抑制肿瘤生长。经FDA批准用于治疗结肠癌和肺癌的西妥昔单抗 (Cetuximab)也属中和抗体类药物，可以竞争性的抑制EGFR及其配体的结合，进而抑制肿 瘤细胞生长，诱导其调亡。
[0004] 所谓C-Met的中和抗体，就是能与C-Met结合，占据C-Met与HGF结合的关键结构 域，阻止两者结合，阻断HGF/C-Met信号转导，进而抑制肿瘤细胞增殖生长。而C-Met与HGF 结合的关键结构域是其胞外区ED，特别是胞外区的IPT3-4结构域。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种肝细胞生长因子受体关键结构域融合蛋 白及其应用，该融合蛋白可特异性的与肝细胞生长因子结合，在筛选阻断C-Met/HGF信号 转导通路进而抑制肿瘤生长的中和抗体药物研发方面具有重大作用。
[0006] 本发明的一种肝细胞生长因子受体关键结构域融合蛋白，所述融合蛋白由表皮生 长因子受体的强信号肽、肝细胞生长因子受体关键结构域及His标签构成；其中，肝细胞生 长因子受体的关键结构域为胞外区ED(Extracellulardomain)或免疫球蛋白-plexin-转 录因子同源结构域 3-4IPT34(Immunoglobulinplexintranscriptionfactorhomology Domains);ED的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示或是该序列的变体，ED的氨基酸序列如 SEQIDN0:2所示或是该序列的变体；IPT34的核苷酸序列如上述序列SEQIDN0:1中 2152-2724核苷酸序列所示或是该序列的变体，IPT34的氨基酸序列如上述序列SEQID NO:2中718-908氨基酸序列所示或是该序列的变体。
[0007] 所述表皮生长因子受体的强信号肽的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，氨基酸序 列如SEQ ID N0:4所示。
[0008] 所述融合蛋白一共有940个氨基酸，如SEQ ID NO:5所示，其中1-26位氨基酸是 表皮生长因子受体的强信号肽，27-934位氨基酸是肝细胞生长因子受体ED蛋白，935-940 位氨基酸是6 XHis标签。
[0009] 所述融合蛋白一共有223个氨基酸，如SEQ ID N0:6所示，其中1-26位氨基酸是表 皮生长因子受体的强信号肽，27-217位氨基酸是肝细胞生长因子受体IPT34蛋白，218-223 位氨基酸是6 XHis标签。
[0010] 编码有肝细胞生长因子受体关键结构域融合蛋白的DNA的质粒。
[0011] 编码有肝细胞生长因子受体关键结构域融合蛋白的表达，包括在原核和真核细胞 的表达。
[0012] 所述融合蛋白与肝细胞生长因子特异性结合。
[0013] 本发明的一种肝细胞生长因子受体关键结构域融合蛋白的应用，所述融合蛋白用 于抗体制备。
[0014] 本发明C_Met胞外区（Extracellular domain, ED)包含一个信号素轴向蛋白样的 结构域、一个富含Cys的PSI区域以及四个免疫球蛋白-plexin-转录因子同源结构组成的 1卩1'1-4结构域。现有技术201110215692.8的1?1'4(：是由1?1'1-4组成，而本发明构建的 IPT34只包括IPT3和IPT4。c-Met只有与HGF结合才会被激活，发挥功效。目前，c-Met胞 外区与HGF结合的关键结合位点还不清楚，IPT1-4被认为是关键区域，本发明构建的IPT34 近一步缩小了搜索范围。
[0015] 与现有技术201110215692. 8的融合蛋白相比，本发明更换了 c-MET本身的信号 肽，而用了表皮生长因子受体（EGFR)的强信号肽，此信号肽已经验证过多次，可实现融合 蛋白的胞外表达，并且不改变融合蛋白的三维结构。
[0016] 有益效果
[0017] (1)利用基因工程技术表达了 C-Met的关键结构域ED和IPT34融合蛋白，该区域 是C-Met与其配体HGF结合的关键区域，在其信号传导过程中发挥非常重要的作用。
[0018] (2)为使融合蛋白在293T细胞中高效表达，选用慢病毒表达系统，