一种从发酵液中分离纯化chetracin B的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于分离工程技术领域，具体涉及一种抗肿瘤潜在药物chetracin B的分 离纯化方法。
【背景技术】：
[0002] chetracinB为本实验室从一株来自南极的真菌Oidiodendrontruncatum GW3-13中分离得到一种结构新颖的含有硫桥结构的二酮哌嗪母核的生物碱类化合物（朱 天骄，顾谦群等，一种含多硫键的哌嗪类化合物及其制备方法和用途，ZL201010119068. 3)， 研宄表明该化合物具有较强的细胞增殖抑制活性，其对BGC-823人胃癌细胞、BEL-7402人 肝癌细胞、HCT-8人结直肠癌细胞、A549人非小细胞肺癌细胞、A2780人卵巢癌细胞的IC5Q 分别为〇. 〇ll、〇. 003、0. 013、0. 022、0. 028yM，且在分子水平上该化合物具有HIF-ld抑制 活性（LiyuanLi，DehaiLi，YepengLuan，QianqunGu，andTianjiaoZhu.Cytotoxic MetabolitesfromtheAntarcticPsychrophilicFungusOidiodendrontruncatum， J.Nat.Prod.，2012, 75 :920-927.)，该化合物能用于抗肿瘤药物的开发，具有良好的药用价 值。
[0003] 然而OidiodendrontruncatumGW3-13 的发酵液成分非常复杂且chetracinB的 含量不高，分离过程不仅复杂耗时，且消耗大量有毒有害的有机溶剂，提取收率不高，成本 高，不利于大规模生产。
[0004] 本发明的目的是提供一种从Oidiodendron truncatum GW3-13发酵液中分离纯化 chetracin B的简单、便捷、高效的方法，为从规模化发酵液中分离纯化chetracin B及其药 物开发提供技术支持。
【发明内容】
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[0005] 本发明旨在提供一种从发酵液中分离纯化chetracin B的方法。
[0006] 本发明提供了一种从发酵液中分离纯化chetracin B的方法，所述方法包括步 骤：
[0007] (1)对chetracin B的发酵液进行纱布过滤，收集菌丝体与滤液；滤液和菌丝体用 有机溶剂抽提，浓缩，合并滤液得水溶液；
[0008] (2)步骤（1)水溶液用有机溶剂抽提，减压浓缩；
[0009] (3)步骤（2)浓缩物进行硅胶柱层析，梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩；
[0010] (4)步骤（3)浓缩物采用凝胶柱层析，分段收集，减压浓缩；
[0011] (5)步骤（4)浓缩物进行硅胶柱层析，梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩；
[0012] ⑶重复步骤⑶。
[0013] 其中，步骤（1)中所述有机溶剂为乙酸乙酯或丙酮，浓度为60~100%。
[0014] 所述抽提菌丝体为室温下抽提2~3次，抽提时间为4~10小时。
[0015] 所述减压浓缩为本学科领域常用的方法和设备进行。
[0016] 梯度洗脱收集时，采用薄层层析法（TLC)或者高效液相色谱法（HPLC)跟踪检测收 集液。
[0017] 步骤（3)所述的硅胶为200~300目的层析硅胶。
[0018] 所述的洗脱剂为100%氯仿、氯仿-甲醇（200 : 1-10 : 1)。梯度洗脱收集时，采 用TLC法或者HPLC法跟踪检测收集液。
[0019] 步骤⑷所述凝胶为SephadexLH-20凝胶。
[0020] 本发明步骤（5)具体为：浓缩物与100~200目硅胶按1 : 1比例混匀后上样于 200~300目的硅胶柱中，柱体积与样品体积比为3 : 1，依次用3-5倍柱体积氯仿：甲醇 = 150 : 1-100 : 1的洗脱剂进行梯度洗脱，TLC跟踪监测，收集合并含有目标成分的洗脱 液，减压浓缩，
[0021] 步骤（6)为重复步骤（5)，分段收集，TLC跟踪检测，即可得到纯度为98%的 chetracinB〇
[0022] 以下通过实例对本发明做进一步描述。
【具体实施方式】
[0023] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
[0024] 本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在 100毫升的溶液中溶质的重量。
[0025] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文 中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0026] 在本实施方式中，发酵液的获得按如下方式进行。
[0027] 菌种：OidiodendrontruncatumGW3-13，（CCTCCM2010043)。
[0028] 斜面培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000ml，pH自然。将马铃薯去皮后，切成 小方块煮沸20-30分钟，然后用三层纱布滤去杂质，再加葡萄糖，加17-20g琼脂粉，溶化后 再加水定容至l〇〇〇ml。
[0029] 种子培养基：麦芽糖2_8g，蛋白胨0. 5_3g，玉米粉l_5g，谷氨酸钠2_7g，葡萄糖 10_50g，酵母膏l_5g，七水硫酸镁0.l_lg，磷酸二氢钾0.l_lg，溶于1000ml去离子水。
[0030] 发酵培养基：麦芽糖2-8g，蛋白胨0.5-3g，玉米粉l-5g，谷氨酸钠2-7g，葡萄糖 10_50g，酵母膏l_5g，七水硫酸镁0.l_lg，磷酸二氢钾0.l_lg，溶于1000ml去离子水。
[0031] 培养方法：从斜面培养基上挑取生长良好的菌体，接入经高温灭菌的种子培养基， 培养后接入同样经过高温灭菌的发酵培养基，培养温度25-30°C，培养时间8-10d。
[0032] 本发明中chetracinB的浓度以及纯度测定采用HPLC法，色谱条件如下：
[0033] 色谱柱：正相色谱柱，C0SM0SIL4. 6IDX250mm
[0034] 流速：lmL/min
[0035] 进样量：20yL
[0036] 柱温：3(TC
[0037] 检测波长：280nm
[0038] A溶液：乙酸乙酯
[0039] B溶液：正己烷
[0040] 洗脱方法：
【主权项】
1. 一种从发酵液中分离纯化chetracin B的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 对获得的真菌613-13(0丨(1;[〇(1611(11'〇111:；1〇111〇31：11111613-13)发酵液进行离心或过滤， 收集菌丝体与滤液；菌丝体与滤液均用有机溶剂抽提，浓缩，合并得浓缩物； (2) 步骤（1)浓缩物进行硅胶柱层析，梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩； (3) 步骤（2)浓缩物采用凝胶柱层析，分段收集，减压浓缩； (4) 步骤（3)浓缩物进行硅胶柱层析，梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩； (5) 步骤（4)浓缩物采用硅胶柱层析，梯度洗脱，分段收集，减压浓缩即得本品。
2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（1)所述有机溶剂为乙酸乙酯或丙酮， 浓度为60~100%。
3. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（1)所述室温下抽提菌丝体和滤液2~ 3次，抽提时间为4~10小时。
4. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（2)在减压条件下，浓缩回收有机溶剂， 得浓缩物。
5. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（3)所述有机溶剂为氯仿：甲醇= 1 ： 1〇
6. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（4)所述的洗脱剂为100%氯仿、氯 仿-甲醇（200 : 1-10 : 1)。
7. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤⑷所述的硅胶为200~300目的层析 硅胶。
8. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤（5)所述的洗脱剂为氯仿：甲醇= 150 : 1-100 : 1，分段收集，TLC跟踪检测，含有chetracin B部分减压浓缩，即得纯度高 于 98% 的 chetracin B〇
【专利摘要】本发明提供了一种从真菌Oidiodendron truncatum GW3-13发酵液中提取分离纯化chetracin B的方法，主要包括发酵液过滤，滤液和菌丝体抽提，浓缩，合并滤液，然后经硅胶柱层析及凝胶柱层析，即可获得纯度大于98％的chetracin B。CCTCC M201004320100209
【IPC分类】C07D519-00
【公开号】CN104628744
【申请号】CN201410313384
【发明人】朱天骄, 顾谦群, 柏帅, 李德海, 车茜
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2014年7月3日