检测大鼠毛发状梭菌的试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测大鼠毛发状梭菌的方法，尤其涉及一种检测大鼠毛发状梭菌 的荧光定量PCR试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 泰泽菌是由毛发样芽孢杆菌引起，以感染小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠、仓鼠、家兔等实 验动物为主的细菌性疾病，该细菌可形成芽孢，与其它芽孢杆菌不同的是感染细胞后从繁 殖菌体转变成芽孢是在细胞内完成的，感染可造成实验动物动物肝脏水肿、出血和坏死，弓丨 起实验动物剧烈腹泻和出血性肠炎等病理损害，严重影响实验动物的健康和质量，严重干 扰动物实验的结果。目前该菌的实验室诊断主要依赖病理学、免疫荧光、ELISA等试验，但该 细菌抗体反应不强，同时该菌人工培养不易，仅在高度分化的细胞如肝细胞中可以有生长， 该细菌又是SPF级动物要求排除的细菌种类之一，这就给实验动物质量控制的病原诊断提 出了新的挑战。。
[0003] 根据GB14926-2001，GB18448-2001对实验动物的质量检测采用的方法基本是直 接分离培养病原菌，或用ELISA (酶联免疫)，IEA (免疫酶)、IFA (免疫荧光)、HAI (血凝抑 制)、HI (血凝)、IH (免疫组化法)等间接检测方法[1]。传统的方法虽然可靠，但检测灵敏度 低，耗时长，往往需要几天甚至几周的时间才能获得结果，且微生物的表型会易受环境的影 响，从而给鉴定带来困难，通常一次只能检测一类或少数几类病原，且都要分扩增(培养）与 检测二个阶段进行，快速检测的技术已成为我国实验动物质量检测的瓶颈。近年来PCR技 术在病原诊断中得到广泛应用，根据该病菌所携带的特异性功能基因设计引物，利用荧光 定量PCR方法进行病原检测已逐渐被认可，有许多应用实例。荧光定量PCR反应的主要工 作原理是，在反应体系加入过量的SYBR荧光染料，SYBR荧光染料可以特异性地掺入DNA双 链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不发射荧光产，从而保证荧光信号的 增加与PCR产物的增加完全同步。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测大鼠毛发状梭菌的试剂盒及 其检测方法。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种检测大鼠毛发状梭菌的试剂盒， 包括IOXTaqman PCR缓冲液、50 μ mol · Γ1的上游引物CPF的水溶液、50umol ·厂1的下游 引物CPR的水溶液、dNTP mixture、25mmol · Γ1的MgCl 2水溶液、5U ·厂1的Taq DNA聚合酶 水溶液、标准阳性模板、20 X SYRB Green荧光染料和无菌双蒸水；所述上游引物CPF的序列 如SEQ ID NO. 1所示，下游引物CPR的序列如SEQ ID NO. 2所示；所述标准阳性模板为大鼠 毛发状梭菌DNA。
[0006] 一种检测大鼠毛发状梭菌的方法，该方法为用上述试剂盒对大鼠毛发状梭菌进行 荧光定量PCR检测。
[0007] 进一步地，所述荧光定量PCR检测方法的反应体系为：2 μ L的10 X Taqman PCR缓 冲液；1 μ L浓度为50 μ mol七1的上游引物CPF的水溶液；1 μ L浓度为50umol吨―1的下游 引物 CPR 的水溶液；0. 8 μ L 的 dNTP mixture ; 1. 8 μ L 溶度为 25mmol · Γ1 的 MgCVK溶液； 0. 20 μ L浓度为5U吨―1的Taq DNA聚合酶水溶液；1 μ L标准阳性模板或待测样品；0. 4 μ L 的20 X SYRB Green荧光染料；其余为无菌双蒸水，体系的总体积为20 μ L ;所述PCR反应 程序如下：95°C变性5min，94°C预变性30s，58°C退火30s，72°C度延伸45s，循环35次，最后 72°C度延伸5min。
[0008] 与现存的技术相比，本发明的有益效果是：传统的方法虽然可靠，但检测灵敏度 低，耗时长，往往需要几天甚至几周的时间才能获得结果，且本试验所检测的细菌只能在肝 细胞等高度分化的细胞中生长，普通环境不易培养，从而给鉴定带来困难，本试剂盒提供的 快速检测技术无需要进行微生物培养、扩增与检测同步进行，具有操作简便、快速、特异性 好、灵敏度高等特点，可以替代分离培养等传统诊断方法，可用于实验动物检质量控制。
【附图说明】
[0009] 图1为将本发明试剂盒标准阳性模板（泰泽氏菌DNA)梯度稀释后，进行荧光定量 PCR扩增所得的动力曲线图，横坐标代表循环数，纵坐标代表相对荧光强度，平行于横坐标 的直线代表阈值。
[0010]图2为将本发明试剂盒标准阳性模板梯度稀释后，进行荧光定量PCR扩增所得的 标准曲线图，横坐标代表荧光阈值，纵坐标代表不同稀释度的标准阳性DNA模板的浓度。
[0011] 图3为具体实施例中所述荧光定量PCR扩增产物的熔解曲线图，横坐标代表熔解 温度，纵坐标代表相对荧光强度，特异性毛发状梭菌扩增产物的熔解温度是88度左右。
[0012] 图4为利用本方法对阳性动物样品扩增的扩增曲线。
[0013] 图5为利用本方法对阳性动物样品进行PCR扩增，阳性产物的熔解曲线，从图中可 以看出，扩增结果只有一个主要产物，熔解温度88摄氏度。
[0014]
【具体实施方式】： 下面以实例来说明具体操作实施的方法。
[0015] (1)待检样品的准备 按标准程序采集动物肠道样品，动物麻醉，杀死动物，无菌操作解剖暴露肠管，采集回 盲部内容物或粪便或肛拭子，将上述样品在500 μ L生理盐水中充分振荡溶解，将洗脱液在 98°C中水浴5min备用。
[0016] (2)反应物配制 针对大鼠毛发状梭菌（泰泽氏菌）的特异性功能基因设计特异性引物，上 游弓丨物CPF序列为：5' -AGACCGGAAAACAGGTACAGGG-3' ；下游弓丨物CPR序列为： 5' -TCCACGGAATGAAGCAGGG-3' ；两条引物为PCR扩增过程中使用的特异性扩增毛发状梭状 杆菌16sRNA基因部分序列。
[0017] 配置一下反应物：10XTaqman PCR缓冲液、50 μπιο? · Γ1的上游引物CPF的水溶 液、50umol · Ι71的下游引物CPR的水溶液、dNTP mixture、25mmol · L η的MgCl 2水溶液、 5U吨―1的Taq DNA聚合酶水溶液、标准阳性模板、20X SYRB Green荧光染料和无菌双蒸水； 所述上游引物CPF的序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物CPR的序列如SEQ ID NO. 2所示； 所述标准阳性模板为毛发样梭状杆菌DNA。
[0018] (3)标准曲线及模板初始浓度的计算 将标准模板进行连续10倍稀释（如1〇2、1〇3、1〇4、1〇 5、1〇6、1〇7)，形成梯度浓度的标准 模板，进行PCR扩增，每个浓度设3个重复，以减少误差。得到不同稀释倍数的动力曲线图， 如图1所示。
[0019] PCR扩增的反应体系为：2 μ L的IOXTaqman PCR缓冲液；1 μ L浓度为50 μπιο?七1 的上游引物CPF的水溶液；1 μ L浓度为50umol · Γ1的下游引物CPR的水溶液；0. 8 μ L的 dNTP mixture ;1· 8 μ L 溶度为 25mmol .171 的 MgCl 2水溶液；0· 20 μ L 浓度为 5U ·厂1 的 Taq DNA聚合酶水溶液；1 μ L稀释后的标准阳性模板；0. 4 μ L的20 X SYRB Green荧光染料；其 余为无菌双蒸水，体系的总体积为20yL ;所述PCR反应程序如下：95°C变性5min，94°C预 变性30s，58°C退火30s，72°C度延伸45s，循环35次，最后72°C度延伸5min。
[0020] 根据图1中的荧光阈值和不同稀释度的标准阳性模板的浓度，得到稀释倍数的对 数值和Ct值得到标准曲线关系式Ct=-3. 0679 X log (X)+34. 086, R2=0. 9992,根据标准曲线 和所得的C (t)值计算起始模板的浓度，其中X表示细菌浓度，如图2所示。根据标扩增曲 线和标准曲线可以看出，当Ct值为13. 0-31. 0时呈阳性，也就细菌浓度介于102~107CFU/mL 时扩增结果才有意义，扩增下限约为50CFU/mL。
[0021] 按步骤1准备的动物样品，对13份临床ELISA检测阳性动物样品在本发明的 PCR扩增的反应体系中进行扩增，体系为：2 yL的IOXTaqman PCR缓冲液；I yL浓度为 50 μ mol · I71的上游引物CPF的水溶液；1 μ L浓度为50umol · L 4的下游引物CPR的水溶 液；〇· 8 μ L 的 dNTP mixture ; L 8 μ L 溶度为 25mmol .I71 的 MgCl 2水溶液；0· 20 μ L 浓度为 5U吨―1的Taq DNA聚合酶水溶液；1 μ L待测样品；0. 4 μ L的20 X SYRB Green荧光染料；其 余为无菌双蒸水，体系的总体积为20yL ;所述PCR反应程序如下：95°C变性5min，94°C预 变性30s，58°C退火30s，72°C度延伸45s，循环35次，最后72°C度延伸5min。
[0022] 结果见表1，根据上述判断标准，共检出毛发状梭状杆菌12份，检出率92. 2%，部 分样品的扩增曲线见图4,熔解曲线见图5从图中可以看出，扩增产物形成单峰，融解温度 87. 2-88. 7度。由上可知，本发明的试剂盒快速、特异性好、灵敏度高，可以替代分离培养等 传统诊断方法，可用于实验动物检质量控制。
[0023] 表1利用本方法对13份阳性动物样品的扩增结果._
【主权项】
1. 一种检测大鼠毛发状梭菌的试剂盒，其特征在于，包括lOXTaqman PCR缓冲液、 50 ymo 1 ? I71的上游引物CPF的水溶液、50umo 1 ? L_1的下游引物CPR的水溶液、dNTP、 25mmol ? I71的MgCl 2水溶液、5U ? L -1的Taq DNA聚合酶水溶液、标准阳性模板、20XSYRB Green荧光染料和无菌双蒸水；所述上游引物CPF的序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物CPR 的序列如SEQ ID NO. 2所示；所述标准阳性模板为大鼠毛发状梭菌DNA。
2. -种检测大鼠毛发状梭菌的方法，其特征在于，该方法为使用权利要求1所述的试 剂盒对大鼠毛发状梭菌进行荧光定量PCR检测。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR检测的反应体系为： 2 y L的10 X Taqman PCR缓冲液；1 y L浓度为50 y mol吨-1的上游引物CPF的水溶液；1 y L 浓度为50umol ? I71的下游引物CPR的水溶液；0. 8 y L的dNTP ;1. 6 y L溶度为25mmol ?厂1 的MgCljK溶液；0. 20 y L浓度为5U *L ―1的Taq DNA聚合酶水溶液；1 y L标准阳性模板或 待测样品；〇.4yL的20XSYRB Green荧光染料；无菌双蒸水加至总体积为20yL ;所述PCR 反应程序如下：95°C变性5min，94°C预变性30s，58°C退火30s，72°C度延伸45s，循环35次， 最后72°C度延伸5min。
【专利摘要】本发明公开了一种检测大鼠毛发状梭菌的试剂盒，以及一种检测大鼠毛发状梭菌的荧光定量PCR方法。该方法通过分析比较大鼠毛发状梭菌(泰泽氏菌)的基因组数据，针对大鼠毛发状梭菌(泰泽氏菌)的特异性功能基因设计特异性引物，进行荧光定量PCR诊断，根据片段大小及退火温度等因素来判断试验结果。该试剂盒提供的快速检测技术无需要进行微生物培养、扩增与检测同步进行，具有操作简便、快速、特异性好、灵敏度高等特点，可以替代一直沿用的分离培养的传统诊断方法，并适用于在实验动物检质量控制中推广使用。
【IPC分类】C12R1-01, C12Q1-68, C12Q1-04
【公开号】CN104611448
【申请号】CN201510073363
【发明人】刘月环, 石巧娟, 余强, 王志远, 钟宇森, 吕宇
【申请人】浙江省医学科学院
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年2月12日