一种木本植物的活体表达方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种本本植物的活体表达方法，特别是涉及板栗的活体快速表达方法。
【背景技术】
[0002]随着大量植物基因组的测序完成，越来越多的同源基因和未知基因信息被发掘出来，这些基因的功能企待验证。以突变体为主导的反向遗传学技术是最有效的验证基因功能的手段。这种技术首先需要获得突变体的来源，通过T-DNA插入和转座子插入等可以获得人工突变体，而对于难以通过人工修饰改变基因获得突变体的植物来讲，自然突变是获得突变体的重要来源。对于有突变体而没有完整再生体系的植物来说，可以借助于模式植物如拟南芥、烟草等的同源基因突变体进行验证，但对于与特定性状有关的基因功能的验证则难以利用模式植物突变体来完成，如根瘤、菌根、雄花序发育性状等。即便对于有突变体、转基因再生体系又较完善的木本植物来说，因其为多年生植物，生长周期长，因此通过果实和花的表型变化来验证基因的功能时也面临着漫长的等待过程。
[0003]基于此，一些瞬时、快速的验证基因功能的转化方法被发展出来。原生质体瞬时转化法是利用新鲜组织的原生质体研宄基因功能和调控的一种方法，原生质体(拟南芥)可以达到 90%的转化效率(Sheen J.Signal transduct1n in maize and Arabidopsismesophyll protoplasts.Plant Phys1logy, 2001, 127:1466 - 1475) o 优点是原生质体易于获得、操作，来源不同的原生质体保留了原生质体的同质性和分化状态的特异性。缺点是缺乏细胞之间的互作，只能看到单细胞下基因的表达。病毒介导的基因转化法(FuDQ, Zhu BZ, Zhu HL, et al.Virus-1nduced gene silencing in tomato fruit.Plant J，2005,43(2):299-308)，这是一种利用 TRV(tobacco rattle virus)病毒介导转化的方法，可以侵染叶片和果实等部位，可以高效地验证基因的功能，但这种技术主要依赖于TRV对宿主的侵染敏感性。发根农杆菌介导的毛状根发生的转化方法(Cao QQ, Camp ROD, KalhorMS,Bisseling T,Geurts R.Efficiency of Agrobacterium rhizogenes - mediated roottransformat1n of Parasponia and Trema is temperature dependent.Plant GrowthRegulat1n, 2012，68:459-465)是利用发根农杆菌 rol 基因(root inducing locus)整合到植物体中诱导毛状根的发生，大约一个月左右就可以产生转化的根系。目的基因可以和rol基因共转化，其结果是产生了复合植物，即未转化的茎梢和已转基因的根系。这种技术被广泛地应用于研宄根系的发育、根系与微生物互作的研宄，如根瘤共生和菌根共生等。但是其特点也是它的局限性，仅限于在根系方面的研宄。以上技术的特点是时间周期短、不依赖于再生转基因体系的建立，操作简单、方便、直观。
[0004]前期研宄中本项目组发现了一株自然实生板栗芽变，雄花序短小(Feng YQ, ShenYY, Cao QQ, Qin L, Han ZH.Short catkinl, a novel mutant of Castanea mollissima, isassociated with programmed cell death during chestnut staminate flowerdifferentiat1n.Sci Hortic, 2011，130:434-435)。芽变雄花序在生长发育过程中，中上部发生细胞程序性死亡(PCD)，花序变黄，弯曲，最后枯死脱落，而基部的花序发育正常，雄花序的平均长度2.2cm,只有普通板栗雄花序长度的1/6-1/8。前期研宄还发现，该雄花序的短化与赤霉素密切相关，在芽变雄花序发育的整个过程贝壳杉烯酸氧化酶(KAO)基因表达量显著低于野生型，且活性赤霉素含量也低于野生型(Guo XP1Li XL，Duan Xff, ShenYYjXing Y，Cao QQjQin L Characterizat1n of sckl，a novel Castanea mollissimamutant with the extreme short catkins and decreased gibberellin.Plos One，2012)0鉴于KAO基因与板栗短雄花序发育的紧密关系，迫切需要验证KAO基因的功能。但中国板栗生长周期长，且目前中国板栗转基因再生体系还未建立，因而急需一种有效的方法来验证KAO基因的功能。
【发明内容】
[0005]本发明借助于自然突变的板栗短雄花序芽变介绍一种木本植物板栗的活体快速表达方法。通过构建超表达载体pCAMBIA1304-CmKA0和干扰载体CmKAO-RNAi，在野生和芽变短雄花序的雄花序原基形成期，以农杆菌介导携带有KAO基因载体菌液，分别在雄花序上进行注射和涂抹，建立了板栗花序的瞬时超表达和干扰体系。板栗雄花序活体-瞬时转化系统的建立对于童期长、再生体系不完善的植物来讲，使得在其亲本上验证基因功能得以实现，且大大缩短了转化周期，对于其它植物尤其是木本植物活体-瞬时系统的转化提供了有价值的参考。
[0006]本发明的木本制备的活体表达方法包括以下步骤:
[0007](I)植物样本的制备
[0008]提供植物的RNA样本，加入无RNA活性的DNA酶，消化总RNA中的DNA，测定RNA的完整性和浓度，检测特征吸光度的比值达到要求，得到总RNA样品；使用反转录酶对所述总RNA样品进行反转录得到cDNA，冷冻保存。
[0009](2)超表达载体的构建
[0010]以步骤(I)所述的cDNA为模板进行PCR扩增，对CmKAO基因进行克隆；回收目的DNA片段后，连接T载体；通过蓝白斑(α -互补)筛选和菌液PCR鉴定，获得阳性克隆产物；通过序列分析提取含有T载体的CmKAO重组质粒DNA ;选取pCAMBIA1304载体上多克隆位点的酶切位点，对含有T载体的CmKAO重组质粒DNA及载体质粒DNA进行酶切和连接，培养筛选重组子pCAMBIA1304-CmKA0，通过相同的双切酶检测获得pCAMBIA 1304-CmKA0超表达载体。
[0011](3)农杆菌的侵染转化
[0012]选取一定量的LGV3101农杆菌感受态细胞，加入步骤⑵所述的pCAMBIA1304-CmKA0超表达载体，进行细胞培养，挑取菌落，PCR检测后保存菌种；将菌种在培养基上划线培养，检测0D，用侵染液调节OD值，活化后，用Iml的注射器对活体植物组织进行侵染，毛笔涂抹组织，完成对活体植物的侵染。
[0013](4)植物超表达载体的遗传转化
[0014]含有CmKAO超表达载体的农杆菌分别侵染突变体组织和野生型组织，侵染后采样提取DNA，以1304J为引物进行鉴定，实时荧光定量和半定量PCR检测，完成植物的活体表达。
[0015]进一步，所述步骤(I)中的测定RNA的完整性和浓度为通过1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性以及利用核酸测定仪检测总RNA的浓度；所述特征吸光度比为0D260/280 和 0D260/230。
[0016]进一步，所述步骤(I)中的反转录包括如下步骤:
[0017]配置2-20 μ L反应体系I，其中所述反应体系I包括1-10 μ L的Oligo (dT) 18，1-10 μ g的总RNA，采用RNase free dH20补足溶液总体积，PCR仪中70°C反应5_15min，冰上骤冷3-8min并短暂离心；再在冰上配置2_20 μ L反应体系II，所述反应体系II包括上述反应体系 I 2-20 μ L，1-6 μ L 缓冲溶液，0.2-2 μ L dNTP, 0.1-0.5 μ L RNaseinhibiter, 0.2-2 μ L的反转录酶RTase M-MLV，上述反应体系II在PCR仪中30_50°C下保温0.5-1.5h，70°C喜爱保温10-20min，冰上冷却后，-20°C下保存。
[0018]进一步，所述步骤(2)中的PCR扩增包括使用引物CmKAO-BP，例如用LA Taq酶对cDNA 进行扩增，所述引物 CmKAO-BP 为 F:5’ -GGAAGATCTGATGGAGTTGGGTCCTATCTGCAACG-3，R:5’ -GGATCCACGTGTTAGAGAGAAGAAGAGGGACATTTC-3’。
[0019]进一步，所述PCR扩增包括如下步骤:
[0020]配置1-5 yL 的 PCR 缓冲液，0.2-2 μ L 的 cDNA，0.2_2 μ L 的上游引物，0.2-2 μ L的下游引物，0.2-2 μ L 的 dNTPs，0.1-0.5 μ L 的 LA Taq DNA 聚合酶，7-20 μ L 的 ddH20，混匀离心后，在PCR仪中80-98 0C下预变性3-8min，按以下程序进行PCR扩增:80-98 V变性20-60s，60-70°C退火 20_60s，70_75°C延伸 60_100s，共 35 个循环，最后 70_75°C延伸 1min结束反应，I %琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
[0021]进一步，所述步骤⑵中的T载体为pMD