一种在大肠杆菌中制备诺如病毒病毒样颗粒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物和医药技术领域，具体而言，涉及一种在大肠杆菌中制备诺如病 毒病毒样颗粒的方法。
【背景技术】
[0002] 诺如病毒（Noroviruses，NoV)是全球范围内引起成人和儿童非细菌性急性胃肠 炎暴发流行的重要病原体，同时也是婴幼儿散发性胃肠炎的常见病原（仅次于轮状病毒）， 近年来其发病率呈逐渐升高的趋势。目前已知NoV有5个基因组，其中仅I、II、IV组感染 人。自20世纪90年代中期首次确认G II -4型NoV毒株导致绝大部分NoV胃肠炎暴发和 世界性大流行后，NoV G II -4型毒株一直为全球优势流行株。发明人于2013年成功在腹 泻病人粪便样本中分离到诺如病毒2012悉尼大流行株类似株，命名为Jingzhou20140403， 我们对该分离株进行了全基因组测序，并递交到了 NCBI的核酸序列数据库中（Genbank登 录号：KF306214)。
[0003] 诺如病毒为单正链RNA病毒，基因组全长7. 5-7. 7kb，有多聚A尾巴。基因组有三 个开放阅读框，开放阅读框1，2和3,分别编码多聚蛋白、主衣壳蛋白（VPl)和次衣壳蛋白。 主衣壳蛋白结构上可以分成两个结构域：衣壳区（Shell domain)和突出区（Protruding domain);其中突出区为主要的受体结合位点并含有主要的免疫表位。该病毒目前还不能进 行体外培养，但是已经证明主衣壳蛋白在昆虫细胞表达后可以自组装成病毒样颗粒（Virus like particle)。用杆状病毒表达诺如病毒的VP1,所形成的VPLs在形态、结构和抗原特 性方面均与野生型病毒类似。
[0004] 目前大规模制备诺如病毒的病毒样颗粒的方法有重组杆状病毒表达系统，酵母表 达系统和植物表达系统等。其中使用最广泛的是重组杆状病毒表达系统。其特点为表达量 高，易于纯化，而且已有相关的疫苗上市，这给其它疫苗研发和报批提供了模板。酵母表达 系统有和重组杆状病毒表达系统相似的优点。但是上述表达系统表达的病毒样颗粒都存在 大小不同的两种颗粒，且两种颗粒比例不易控制，这为后续的疫苗质量控制带来了一定的 困难。目前诺如病毒相关的临床研宄都是以重组杆状病毒表达系统制备的病毒样颗粒作为 免疫原。重组杆状病毒表达系统制备诺如病毒样颗粒一般为首先制备获取包含编码诺如病 毒主衣壳蛋白的重组杆状病毒，然后用制备的杆状病毒去感染昆虫细胞，随后从细胞裂解 液或者细胞上清中纯化病毒样颗粒。纯化方法一般为低速离心去细胞碎片，然后超高速离 心沉淀病毒样颗粒，用水或者PBS复溶沉淀后用氯化铯等密度梯度离心进一步纯化。最后 对抽取含有目的条带的组分进行超高速离心或者浓缩管离心去除氯化铯。另外一种方法是 通过超滤，分子筛加离心交换进行纯化。第一种方法适合小规模病毒样颗粒制备，后一种方 法一般为工业级抗原制备。
[0005] 2002年俄亥俄州辛辛那提儿童医院医疗中心开发了一个只包含病毒颗粒突出区 的亚病毒样颗粒（P颗粒）。LigoCyte购买了这个"P颗粒"疫苗的专利，但还没有把它推向 临床试验。但动物实验表明该P颗粒免疫原性不及病毒样颗粒。此外，该方法制备P颗粒 需要进行体外酶切把标签蛋白和目的蛋白进行分离，不仅费时，费力，增加了费用，同时不 可避免引入外源蛋白污染（不能有效酶切的目的蛋白）。
[0006] 综上，现有表达系统都具有成本高，制备费时费力等缺点，此外，通过现有方法制 备的病毒样颗粒大小不均一，如利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达制备诺如病毒病 毒样颗粒，其颗粒大小比例受培养条件的影响，单层培养细胞时获得的大颗粒比例可以达 到80%以上，但悬浮培养时小颗粒可以达到80%以上，因此，需要一种更好的诺如病毒病 毒样颗粒的制备方法。
【发明内容】
[0007] 我们通过实验摸索，找到了一种在大肠杆菌中制备诺如病毒病毒样颗粒的方法。 与现行的制备诺如病毒病毒样颗粒的方法相比，本方法具有快速，简单，成本低等优点。此 外和其它表达系统相比，不会引入过多的外源因子。例如杆状病毒表达系统会不可避免引 入昆虫细胞宿主蛋白和DNA以及杆状病毒结构和非结构蛋白和DNA，所以后续的疫苗还需 有灭活以确保杆状病毒被有效灭活。而本发明中使用的是大肠杆菌。大肠杆菌是人体的正 常共生菌，不会对人体带来潜在的风险。此外，通过添加标签，我们使最终表达的病毒样颗 粒大小均一，稳定性得到了提高。
[0008] 为了解决颗粒大小不均一和稳定性不好的问题，我们在VPl蛋白N端添加了一个 五肽，含有该五肽的VPl-M蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示）在细菌中表达后仍然 组装形成了病毒样颗粒，这种颗粒稳定性得到了提高，其大小颗粒也比较均一。
[0009]
【主权项】
1. 一种诺如病毒病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤： (1) 酶切扩增诺如病毒主衣壳蛋白编码序列片段和质粒载体，连接酶连接并转化感受 态大肠埃希菌DH5a ; (2) 扩增表达转化成功的大肠杆菌宿主菌株； (3) 纯化扩增表达的宿主菌株中的诺如病毒主衣壳蛋白颗粒。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中所述的引物序列为： NoVFL-F GGAATTCCATATGNNNNNNNNNNNNATGAAGATGGCGTCGAGTGACGCCAAC NoV-R CGGGATCCTTATAGTGCACGTCTACGCCCCGT。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)所述的连接及转化方法为： 用Ndel和BamHI同时酶切扩增片段目的序列和pCold载体，回收目的片段和载体片段， 以T4DNA连接酶室温连接10-30分钟，连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5 a，随机挑选 单克隆，接种于LB培养基中，菌落PCR鉴定正确的菌株加入终浓度为30 %灭菌甘油保存 于-8(TC〇
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)所述的扩增表达方法为：取适量 冻存菌液接种于LB培养基中，37°C振荡培养，待菌液A_= 0. 4-0. 8时，转移至15°C放置30 分钟，然后加入IPTG至终浓度为0. 1-0. 5mM/L，15°C诱导24-72小时。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)所述的纯化方法为下述方法一或 方法二， 方法一： 将细菌裂解液上清于4°C条件下，12000x g离心30分钟，收集上清； 根据上清体积加入适量饱和硫酸铵使成33%饱和度硫酸铵溶液，4°C搅拌下沉淀过 夜； 4°C条件下，12000x g离心20分钟，弃上清； 沉淀用无菌PBS溶液重悬过夜，重悬液低速离心去除不溶物质，上清经凝胶层析收集 目的蛋白，加入饱和硫酸铵溶液使成33%饱和度硫酸铵溶液，4°C搅拌下沉淀过夜； 4°C条件下，12000x g离心20分钟，弃上清； 沉淀用无菌PBS重悬过夜，重悬液低速离心去除不溶物质； 方法二： 细菌裂解液上清直接采用25%蔗糖垫底，28000印111，41：下离心3小时沉淀蛋白； 沉淀蛋白采用无菌PBS复溶，复溶后蛋白采取低速离心去除不溶蛋白，离心参数为 10000x g，30分钟，上清和等体积1. 6g/ml氯化铯水溶液混合，41000rpm，10°C下离心18-24 小时，抽取目的蛋白条带。
6. 权利要求1-5任一所述的诺如病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述的诺 如病毒病毒样颗粒蛋白为VP1-M，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
7. 权利要求1-6任一所述的诺如病毒病毒样颗粒的制备方法制备获得的诺如病毒病 毒样颗粒。
8. 权利要求1-6任一所述的诺如病毒病毒样颗粒的制备方法在制备诺如病毒抗原或 疫苗中的应用。
9. 权利要求1-6任一所述的诺如病毒病毒样颗粒的制备方法在制备重组诺如病毒或 诺如病毒病毒样颗粒中的应用。
10.表达权利要求7所述的诺如病毒病毒样颗粒的编码基因。
【专利摘要】本发明涉及一种在大肠杆菌中制备诺如病毒病毒样颗粒的方法，包括如下步骤：(1)酶切扩增诺如病毒主衣壳蛋白编码序列片段和pCold载体，连接酶连接并转化感受态大肠埃希菌DH5α；(2)扩增表达转化成功的大肠杆菌宿主菌株；(3)纯化扩增表达的宿主菌株中的诺如病毒主衣壳蛋白颗粒。该方法制备的病毒样颗粒稳定性高，其大小颗粒也比较均一。
【IPC分类】C12N7-04, C12N15-70, A61P31-14, A61K39-12, C12N15-40
【公开号】CN104611358
【申请号】CN201510086159
【发明人】申硕, 霍玉奇, 王泽鋆, 孟胜利
【申请人】武汉生物制品研究所有限责任公司
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年2月17日