用于制备磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)单抗的人工半抗原、制备方法及获得的单克隆抗体的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学免疫检测技术，特别是用于制备磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3) 单抗的人工抗原、制备方法及获得的单克隆抗体。
【背景技术】
[0002] 肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC)是目前全世界发病率很高的第五大 癌症，我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45%。目前外科手术切除肿 瘤仍是治疗HCC最好、最快捷的方法。然而，大多数患者就诊时已失去了最佳治疗时机，能 够早期手术切除者只占10-20%，即使手术切除，复发率仍很高。所以早期发现、早期诊断、 早期治疗HCC是提高患者生存率的关键，也是预后和治疗的关键。
[0003] 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (glypican-3,GPC3)，其基因位于人染色体X26ql,长 900kb,GPC3开放阅读框有1740bp,编码580个氨基酸，分子量为66kD。GPC3基因编码的 蛋白属于硫酸已酰肝素蛋白聚糖（heparansulfateproteoglycans,HSPGs)，通过糖基磷 脂酰蛋白（glycosyl-phosphatidylinositolanchor，CPI)销定在细胞表面，可结合生长因 子等，调控着细胞生长、繁殖、分化、黏附和迀移等行为。研宄证实GPC3蛋白在肝癌组织中 高表达，而在非癌组织中没有表达或表达极少，并能在血中检测到。用免疫组化的方法检 测GPC3阳性者在80%以上。而其他良性肝病和正常肝组织中表达率为0,其特异度应在 90%以上。另外，GPC3在对于小肝癌在血清中的检出率明显高于AFP，两者分别是56. 3% 和31. 3%。因此，GPC3对HCC的诊断率明显高于AFP，尤其在AFP阴性的早期肝癌的诊断 中发挥重要作用。
[0004] 另外，GPC3对于肝癌而言或许不仅仅可以用于诊断，在肝癌的治疗方面也有所帮 助。由于GPC3在肝癌中高度特异性的表达，因而可以将其作为一种肝癌免疫治疗的靶点， 选择一种对GPC3有高度亲和力的载体，通过该载体将能杀伤癌细胞的物质如化疗药、放射 性核素、毒蛋白等运送到肿瘤靶细胞，从而可以对该肿瘤靶细胞产生选择性的杀伤作用。
[0005] 然而，目前市场上销售的商品化的GPC3抗体多为多克隆抗体，活性较低且试验结 果很不稳定，直接影响到实验研宄的深入开展及在肝癌治疗中的应用。
【发明内容】
[0006] 本发明根据上述领域的空白和需求，提供用于制备磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3(GPC3) 单抗的人工抗原、制备方法及获得的单克隆抗体。
[0007] -种磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3人工半抗原，其特征在于，其氨基酸序列如SeqID No. 1所示。
[0008] 所述的人工半抗原在制备磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3单抗中的用途。
[0009] -种磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0010] (1)采用抗原免疫动物，
[0011] ⑵细胞融合，
[0012] (3)单抗筛选，
[0013] (4)腹水制备和抗体纯化；
[0014] 其特征在于，所述抗原为氨基酸序列如SeqIDNo. 1所示的多肽与匙孔血蓝蛋白 偶联而得的偶联物。
[0015] -种磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3的单克隆抗体，其特征在于，是采用所述的人工半抗 原与匙孔血蓝蛋白偶联而得的偶联物为免疫原制备筛选而得。
[0016] 所述的单克隆抗体，是保藏号为CGMCCNo. 10315的杂交瘤细胞所分泌。
[0017] -株分泌磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CGMCC No.10315。
[0018] -种用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的免疫检测试剂盒，其特征在于包括捕捉 抗体，所述捕捉抗体为所述的单克隆抗体。
[0019] 一种用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3的蛋白质印迹试剂盒，其特征在于，包括针 对检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的探针，所述探针为所述的单克隆抗体。
[0020] 上述的单克隆抗体在肝癌细胞研宄中的用途。
[0021] 本发明的发明思路基于下述三方面的考虑。第一，GPC3广泛表达于肝癌细胞表面， 是肝癌早期诊断和靶向性治疗的主要的标靶；第二，市场上销售的商品化GPC3抗体多为多 克隆抗体，并且效价极不稳定，直接影响到科学研宄的深入开展及在肝癌治疗中的应用；第 三，我们选择多个抗原表位进行多肽合成、动物免疫、杂交瘤融合及腹水制备等抗体制备方 法结合实际的科研实验进行验证，从而大大提高抗体制备效率。
[0022] 基于本发明的成果，本发明请求保护用于制备单抗的人工抗原，其氨基酸序列如 SeqIDNo. 1 (选自来源于NP_004475. 1的一段）所示。本发明还请求采用该人工抗原制备 单抗的方法，以及获得的单抗，单抗的用途即采用该单抗的试剂盒。
[0023] 本发明提供GPC3单克隆抗体，抗体特异性强，并且效价高，ELISA检测效价可达1 : 400000,因此试验中GPC3抗体使用浓度较低，抗体用量较少。
[0024] 可用于针对GPC3抗原的免疫焚光和蛋白印迹（Westernblotting)等科学研宄。
[0025] 生物保藏信息：
[0026] 保藏号：CGMCCNo. 10315
[0027] 保藏日期：2015年1月21日
[0028] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0029] 保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮政编 码：100101
【附图说明】
[0030] 图1.小鼠融合前血清ELISA检测结果曲线图
[0031] 其中，横坐标为表1所示的8个不同的效价梯度，纵坐标为0D450值。
[0032] 图2.免疫荧光方法中采用GPC3单克隆抗体检测肝癌细胞系HepG2细胞中GPC3
[0033] 第一列为GPC3抗体免疫荧光（Cy3标记二抗）在肝癌细胞系H印G2细胞表面的显 色，第二列为采用DAPI染细胞核，为蓝色（100X油镜下），第三列为第一列及第二列的合成 图。图3.采用GPC3单克隆抗体的蛋白质印迹方法检测肝癌细胞中的GPC3。
[0034] 其中，三株抗体都可在肝癌细胞系H印G2中表达，分子量约为70KD，0 -actin为阳 性对照，约45KD。
【具体实施方式】
[0035] 实施例I.GPC3单克隆抗体制备
[0036] 1.免疫原的制备
[0037] 选取GPC3蛋白序列（来源于NP_004475. 1)第528-543位氨基酸序列（SEDID NO. 1YDLDVDDAPGNSQQAT)进行多肽合成作为人工半抗原。
[0038] 多肽合成由艾比玛特生物医药（上海）有限公司合成并进行纯化。
[0039] 纯化后的多肽分别与匙孔血蓝蛋白（KLH)和牛血清白蛋白（BSA)偶联，偶联反应 按照美国Pierce公司的试剂盒（ImjectMaleimideActivatedImmunogenConjugation KitWithmcKLHandBSA)操作说明书进行偶联后即刻过柱纯化、分装。
[0040] 多肽-KLH偶联复合物用于免疫小鼠，多肽-BSA偶联复合物用于ELASA检测小鼠 血清和杂交瘤细胞上清及腹水的抗体效价。
[0041] 2?动物免疫
[0042] 将合成的蛋白抗原多肽-KLH分别免疫鼠龄为6-8周的雌性BALB/C健康小鼠，第 一次免疫用等量完全弗氏佐剂（CFA)充分乳化抗原，每只小鼠注射抗原量IOOug/只，加强 免疫两次，每次间隔两周，用等量不完全弗氏佐剂（IFA)乳化抗原。第二次和第三次免疫后 10天取小鼠尾静脉血清检测抗体效价，根据结果决定是否再行加强免疫。挑选出三只体内 抗体效价高的小鼠，选择免疫反应最好的小鼠脾脏进行融合。（见表1和图1)。
[0043] 表1.小鼠融合前血清ELISA检测数据表
[0044]
【主权项】
1. 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3人工半抗原，其特征在于，其氨基酸序列如Seq ID No. 1所示。
2. 权利要求1所述的人工半抗原在制备磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3单抗中的用途。
3. -种磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3的单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤： (1) 采用抗原免疫动物， (2) 细胞融合， (3) 单抗筛选， (4) 腹水制备和抗体纯化； 其特征在于，所述抗原为氨基酸序列如Seq ID No. 1所示的多肽与匙孔血蓝蛋白偶联 而得的偶联物。
4. 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3的单克隆抗体，其特征在于，是采用权利要求所述的人 工半抗原与匙孔血蓝蛋白偶联而得的偶联物为免疫原制备筛选而得。
5. 根据权利要求4所述的单克隆抗体，是保藏号为CGMCC No. 10315的杂交瘤细胞所分 泌。
6. -株分泌磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的单克隆抗体的杂交瘤细胞，保藏号为CGMCC No.10315。
7. -种用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3的免疫检测试剂盒，其特征在于包括捕捉抗 体，所述捕捉抗体为权利要求4或5所述的单克隆抗体。
8. -种用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖_3的蛋白质印迹试剂盒，其特征在于，包括针对 检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的探针，所述探针为权利要求4或5所述的单克隆抗体。
9. 权利要求4或5所述的单克隆抗体在肝癌细胞研宄中的用途。
【专利摘要】本发明“用于制备磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)单抗的人工半抗原、制备方法及获得的单克隆抗体”，属于医学免疫检测技术，人工抗原其氨基酸序列如Seq ID No.1所示。本发明还提供了采用上述人工抗原制备磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3单抗的方法，以及制备而得的单抗及该单抗检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的用途。根据本发明的方法筛选到的一株单抗，效价达到1:400000，特异性强。可用于针对GPC3的免疫荧光和蛋白印迹(Western blotting)检测方法及科学研究。CGMCC No.103152015.01.21
【IPC分类】G01N33-68, C12N5-20, G01N33-574, G01N33-577, C07K14-47, C07K16-18
【公开号】CN104610441
【申请号】CN201510097025
【发明人】赵焕英, 李莉, 赵君朋, 张进禄, 隋雷鸣, 武文琦, 李蕾, 方霄, 吴兵
【申请人】首都医科大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年3月4日