基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种寡糖非还原胺化衍生化的方法，尤其是涉及一种基于含磷苯胺衍 生物的寡糖非还原胺化衍生化方法，包括以含磷苯胺衍生物为衍生化试剂，在甲醇水混合 溶剂中使寡糖衍生化的反应。具体来讲，所述方法使用还原性寡糖为寡糖原料，含磷苯胺衍 生物为衍生化试剂，在甲醇水混合溶剂中反应生成含磷苯胺衍生物衍生化的寡糖。
【背景技术】
[0002] 蛋白质的糖基化修饰是一种重要的翻译后修饰，它参与、调控生命体的众多生物 功能，比如说胚胎的发育、蛋白的折叠、细胞粘附、免疫响应等等。其生物功能的多样性源于 寡糖的结构复杂性。因此，糖蛋白上寡糖结构的分析及鉴定对理解其生物功能具有非常重 要的意义。在诸多技术手段中，质谱技术因其快速、灵敏、样品消耗量少等特点在寡糖结构 的分析、鉴定中发挥了越来越重要的作用。
[0003] 寡糖在质谱中的离子化效率较低，一直制约着质谱技术在糖检测领域的发展，因 此一般需要对寡糖进行衍生化。传统的还原胺化衍生化方法需要用到毒性高的还原试剂， 如硼氢化钠，而且与下游的质谱检测不兼容，需要繁琐的分离纯化步骤，容易造成样品损 失。后来又发展了非还原胺化衍生化法，如利用3-氨基喹啉、2-氨基吡嗪及苯胺作为非还 原胺化衍生化试剂。
[0004] 研宄表明，磷酰基在ESI质谱分析中具有较强的增敏效应。将氨基酸氮端磷酰化 修饰后进行MALDI-MS检测，发现磷酰基可以有效抑制低分子量区域的基质峰的干扰，增强 小分子氨基酸的MALDI质谱信号。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于结合苯胺与还原糖的非还原胺化反应及磷酰基在MALDI-MS中 的增敏效应，提供一种工艺较为简单的基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方 法。
[0006] 本发明包括以下步骤：
[0007] 1)将含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液与麦芽五糖水溶液混合，水浴反应 后，利用MALDI-MS考察含磷苯胺衍生物对麦芽五糖的衍生化效果；
[0008] 2)以NA2、核糖核酸酶B上连接的寡糖及鸡卵清蛋白上连接的寡糖为寡糖来源，考 察高分子量寡糖、复杂寡糖库的衍生化效果及质谱增敏效应。
[0009] 在步骤1)中，所述将含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液与麦芽五糖水溶液混 合以麦芽五糖为模型；所述含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液可采用含有lmg/mL含磷 苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液，乙酸-甲醇溶液中乙酸与甲醇的体积比可为1:9;所述含 有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液与麦芽五糖水溶液的体积比可为1 : 1，所述麦芽五糖 水溶液的浓度可为100Ug/mL;所述水浴反应的条件可在75°C水浴反应3h;所述含磷苯胺 衍生物如表1所示。
[0010] 与现有的方法相比，本发明具有以下突出优点：
[0011] 1)可以广泛应用到各种还原性寡糖及复杂寡糖库；
[0012] 2) "一步衍生化"；
[0013] 3)操作简单，无需纯化；
[0014] 4)反应时间短（约3h);
[0015] 5)衍生化效率可达到95%以上；
[0016] 6)质谱中响应信号及信噪比提高约2?5倍。
【附图说明】
[0017] 图1是基于含磷苯胺衍生物作为非还原胺化衍生化试剂的寡糖衍生化方法反应 通式。
[0018] 图2是在最佳条件下，未衍生化的麦芽五糖（A)及应用本方法衍生化的麦芽五糖 (B)的质谱图。横轴为质荷比（m/z)，纵轴为信号强度（Intensity)。
[0019] 图3是在最佳条件下，未衍生化的NA2 (A)及应用本方法衍生化的NA2 (B)的质谱 图。横轴为质荷比（m/z)，纵轴为信号强度（Intensity)。
[0020] 图4是在最佳条件下，来源于核糖核酸酶B的未衍生化的寡糖混合物（A)及 应用本方法衍生化的寡糖混合物（B)的质谱图。横轴为质荷比（m/z)，纵轴为信号强度 (Intensity)〇
[0021] 图5是在条件下，来源于鸡卵清蛋白的未衍生化的寡糖混合物（A)及应用本方法 衍生化的寡糖混合物（B)的质谱图。横轴为质荷比（m/z)，纵轴为信号强度（Intensity)。
【具体实施方式】
[0022] 本发明涉及一种寡糖的基于含磷苯胺衍生物的非还原胺化衍生化方法，以 4-DPPBA为例，其反应的通式如图1所示。
[0023] 表1是本发明中所涉及的含磷苯胺衍生物分子结构式。图2?5中所涉及的含磷 苯胺衍生物均以4-DPPBA为例加以说明。
[0024]表1
[0025]
【主权项】
1. 基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 将含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液与麦芽五糖水溶液混合，水浴反应后，利 用MALDI-MS考察含磷苯胺衍生物对麦芽五糖的衍生化效果； 2) 以NA2、核糖核酸酶B上连接的寡糖及鸡卵清蛋白上连接的寡糖为寡糖来源，考察高 分子量寡糖、复杂寡糖库的衍生化效果及质谱增敏效应。
2. 如权利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法，其特征在于 在步骤1)中，所述将含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液与麦芽五糖水溶液混合以麦芽 五糖为模型。
3. 如权利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法，其特征在于 在步骤1)中，所述含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液采用含有lmg/mL含磷苯胺衍生 物的乙酸-甲醇溶液。
4. 如权利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法，其特征在于 在步骤1)中，乙酸-甲醇溶液中乙酸与甲醇的体积比为1 : 9。
5. 如权利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法，其特征在于 在步骤1)中，所述含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液与麦芽五糖水溶液的体积比为 1 ： 1〇
6. 如权利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法，其特征在于 在步骤1)中，所述麦芽五糖水溶液的浓度为100 μ g/mL。
7. 如权利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法，其特征在于 在步骤1)中，所述水浴反应的条件是在75°C水浴反应3h。
8. 如权利要求1所述基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法，其特征在于 在步骤1)中，所述含磷苯胺衍生物如表1所示。
【专利摘要】基于含磷苯胺衍生物的寡糖非还原胺化衍生化方法，涉及一种寡糖非还原胺化衍生化的方法。1)将含有含磷苯胺衍生物的乙酸-甲醇溶液与麦芽五糖水溶液混合，水浴反应后，利用MALDI-MS考察含磷苯胺衍生物对麦芽五糖的衍生化效果；2)以NA2、核糖核酸酶B上连接的寡糖及鸡卵清蛋白上连接的寡糖为寡糖来源，考察高分子量寡糖、复杂寡糖库的衍生化效果及质谱增敏效应。1)可以广泛应用到各种还原性寡糖及复杂寡糖库；2)“一步衍生化”；3)操作简单，无需纯化；4)反应时间短(约3h)；5)衍生化效率可达到95％以上；6)质谱中响应信号及信噪比提高约2～5倍。
【IPC分类】C07F9-53, C07F9-40, C07H15-02, G01N27-64, C07H1-00
【公开号】CN104610387
【申请号】CN201510031319
【发明人】刘艳, 甘杰鹏, 袁航, 赵玉芬
【申请人】厦门大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月22日