一种利用整合宿主因子来提高pcr扩增灵敏度的方法
【专利说明】-种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法 【技术领域】
[0001] 本发明涉及涉及一种用于以聚合酶链式反应（PCR)为基础的核酸分子扩增技术 的方法，包括线性单元、多元（multiplex)以及套式（nest)PCR反应，主要涉及一种利用耐 热的、与DNA双链结合的整合宿主因子（IHF)来提高PCR扩增效率的方法。 【【背景技术】】
[0002]PCR是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段，这种方法可在生物体外进 行，不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。聚合酶链式反应技术被广泛地运用在医学和生 物学的实验室，例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复 制，以及亲子鉴定等。
[0003] 在实际应用中，特别是用现有的PCR技术诊断传染病的时候，仍存在一些根本的 问题亟需改进，如特异性、灵敏度、反应速度等问题，特别是为了使被传染性病毒在早期感 染初就能被诊断出来，因此PCR的灵敏度就显得非常的重要。研究人员已经将增效剂如聚 右旋糖酐（Dextran)等树状大分子引入PCR体系，这些增效剂在一定程度上可以起到增加 PCR扩增效率的作用，但在实际应用过程中，有时效果却不尽如人意，甚至会抑制PCR的扩 增反应。如某些高分子增效剂，在加入反应体系后，会使反应体系粘稠，难以混合均匀，甚至 定量操作等问题。而且在特异性PCR产物的灵敏度增加的同时非特异性PCR产物的灵敏度 也随之增加。
[0004] 美国专利USPATENT5, 646, 019公开了"一种利于引发扩增核酸模板的制备方 法"，该方法是在PCR体系里加入了耐热的单链结合蛋白（SSB，single-strandednucleic acidbindingprotein)，SSB蛋白只结合单链DNA，通过结合并抑制含有单链的非特异性片 段的扩增，从而实现了PCR扩增的优化，但它对提高PCR扩增灵敏度的效果并不十分显著。
[0005] 整合宿主因子（IHF)是耐热的双链结合蛋白，是DNA结合蛋白DNABII家族的一个 成员。除了维持DNA的超螺旋和压缩状态外，这些蛋白对DNA的结构也起到其它更具体的 作用，例如DNA的弯曲，基因转录调控，核蛋白复合物的装配所需的位点特异性重组反应， 和起始于复制原点的复制，以及通过蛋白质-RNA相互作用控制翻译起始等。IHF有两个同 源亚基（IHFa和IHFP)，是DNA序列特异性DNA结合蛋白，可以将DNA弯曲160度以上。 【
【发明内容】
】
[0006] 本发明要解决的技术问题，在于提供一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏 度的方法，该方法能够特异性地、高效地扩增目标核酸序列。
[0007] 本发明是这样实现的：
[0008] -种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法，所述方法如下：将含有脱 氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液中，加入整 合宿主因子IHF，按照常规PCR的解链、退火、延伸三个步骤，进行反复的热循环，从而将目 标核酸片段扩增。
[0009] 进一步地，所述引物与整合宿主因子IHF的摩尔比例为0. 005-1。
[0010] 本发明具有如下优点：
[0011] 本发明可以显著地提高PCR扩增的灵敏度，在增加特异性PCR产物的灵敏度的同 时非特异性PCR产物的灵敏度并不会随之增加。本发明方法有助于解决现有PCR和分子克 隆技术所存在的效率低等问题。填补了有关利用DNA双链结合耐热的蛋白质来提高PCR扩 增效率的方法和应用领域空白。 【【附图说明】】
[0012] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0013] 图1是本发明实施例1的IHF@SDS-PAGE电泳检测图。
[0014] 图2是本发明实施例1的IHF@活性电泳检测图，其以环状的双链DNA作为底物。
[0015] 图3是本发明实施例1的IHF@活性电泳检测图，其以线性状的双链DNA作为底 物。
[0016] 图4是本发明实施例1的IHFP活性电泳检测图，其以线性状的单链DNA作为底 物。
[0017] 图5是本发明实施例2的IHF3对PCR扩增产物电泳示意图。
[0018] 图6是本发明实施例2的IHF3对巢式PCR扩增产物电泳示意图。 【【具体实施方式】】
[0019] 本发明涉及一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法，所述方法如 下：将含有脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应 溶液中，加入整合宿主因子IHF，按照常规PCR的解链、退火、延伸三个步骤，进行反复的热 循环，从而将目标核酸片段扩增。
[0020] 所述引物与整合宿主因子IHF的摩尔比例为0. 005-1。
[0021] 下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内 容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
[0022] 实施例1:IHF的制备
[0023] 1、将来源于大肠杆菌的IHFa或IHFP亚基分别插入PET22b表达载体中，通过 连接转化并用菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体PET22-IHFa或者 PET22-IHF3;
[0024] 2、将构建好的重组载体pET22_IHFa或者PET22-IHF0转化大肠杆菌BL21，取含 重组质粒的阳性菌株加入LB液体培养基中培养过夜，之后菌液按1%比例接种到50ml的 LB培养液中，放入37°C摇床培养至其0D值为0. 6-0. 8 ;加入IPTG，将菌液放入37°C摇床中 诱导表达3小时，摇床转速为160rpm;
[0025] 3、取诱导表达后的菌液离心得到菌体，裂解，释放蛋白质。SDS-PAGE电泳检测蛋白 表达情况。结果如图1的IHFSDS-PAGE电泳检测图所示，IHF大小为10. 5KD。
[0026] 4、IHF的纯化
[0027] 利用上述方法大量培养含重组质粒的阳性菌株。菌液经离心（3000Xg)15min，收 集大肠杆菌菌体，-70°C冷冻放置过夜。
[0028] 菌体悬浮在裂解缓冲液（0? 1M，0? 02MEDTA和0? 2mg/ml蛋清溶菌酶）（pH7. 5)， 30min。冰上超声裂解菌体，裂解液离心（120000Xg)90min。上清液以阴离子交换柱Pr印 Q纯化。以25mMTris/HCl，ImMEDTA(pH7. 5)冲洗，再以NaCl梯度洗脱。之后，以肝素亲 和柱纯化，以NaCl梯度洗脱，得到纯度为95%左右的IHF蛋白原液，S卩IHF蛋白原液的浓度 为：1. 5ng/y1〇
[0029] 经检测，本实验获得的IHFP的DNA序列与文献报道（BonnefoyE等，EMBOJ， 10(3) :687-696,，1991) 一致；GenBank:LM995446. 1 其序列如序列表中SEQIDNO. 1 所示。
[0030] 以下所有实验过程中所用IHF蛋白原液的浓度为：1.5ng/ii1。
[0031] 5、IHF的活性检测（环状的双链DNA作为底物）
[0032] 按照下表配置10yl的反应体系
[0033]
【主权项】
1. 一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法，其特征在于：所述方法如下： 将含有脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液 中，加入整合宿主因子IHF，按照常规PCR的解链、退火、延伸三个步骤，进行反复的热循环， 从而将目标核酸片段扩增。
2.根据权利要求1所述的一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法，其特 征在于：所述引物与整合宿主因子IHF的摩尔比例为0. 005-1。
【专利摘要】本发明提供一种利用整合宿主因子来提高PCR扩增灵敏度的方法，所述方法如下：将含有脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、寡核苷酸引物、以及作为模板的核酸片段的反应溶液中，加入整合宿主因子IHF，按照常规PCR的解链、退火、延伸三个步骤，进行反复的热循环，从而将目标核酸片段扩增，所述引物与整合宿主因子IHF的摩尔比例为0.005-1。本发明方法能够特异性地、高效地扩增目标核酸序列。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104593491
【申请号】CN201410848236
【发明人】戚智青, 唐黎, 张秀英, 侯丹, 刁勇, 齐晓雪, 许瑞安, 马国兴, 杜民
【申请人】华侨大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月31日