一种优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序列及其在预防断奶仔猪腹泻中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种合成的密码子优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序列及 其应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 断奶仔猪腹泻是长期困扰猪场和养殖户的一个难题，不仅带来直接的死亡损 失和巨额的药费开支，还间接影响到康复猪下一阶段的生长速度、育成率，危害相当严 重，成为全球范围内影响提高养猪业经济效益的重要制约因素。肠产毒性大肠杆菌 (enterotoxigenicEsckrichiacoli，ETEC)是断奶仔猪腹泻的主要病原体，也是断奶仔猪 腹泻的重要诱因；其中以F4+、F18+ETEC占据明显优势地位，因此控制F4+、F18+ETEC感染成 为防治断奶仔猪腹泻的关键环节。据报道，从断奶仔猪腹泻样品中分离的ETEC多数表达 Stx2e毒素、STa毒素突变体、LT毒素、STb毒素等。新生仔猪从母体获得的免疫力在断奶 之后就不能有效抵抗病原微生物的感染，疫苗接种将成为是特异性预防ETEC的有效手段， 而安全有效的疫苗是成功地预防、控制ETEC引起的断奶仔猪腹泻的先决条件，然而目前还 没有商品化的疫苗取得成功。
[0003] 国内外的科研人员一直都在探索预防断奶仔猪腹泻主动免疫的策略和方法，在基 于F4+ETEC黏附素F4或者其主要成分的FaeG蛋白的亚单位疫苗或基因工程疫苗、核酸疫苗 研宄以及携带黏附素的无毒大肠杆菌口服活疫苗研宄等领域均取得积极进展。这些疫苗免 疫哺乳仔猪虽可以诱导一定程度的免疫应答，但是还不足以保护仔猪免受感染。分析其原 因，除了断奶前后仔猪免疫系统发育尚不完善之外，至少包含以下几点：①研宄使用的蛋白 类抗原口服后，在穿过胃肠屏障时损失较大，所剩免疫原无法有效被仔猪的免疫系统所识 另IJ;②不能在感染发生的部位诱导产生足够多的slgA，而在黏膜免疫应答中slgA才是抵抗 感染的主力军；③母源抗体干扰：针对菌毛粘附素的母源抗体，可能会使疫苗菌株在肠内 无法定居，达不到激活免疫应答的有效细菌数量。④目前的研宄大都是基于F4、F4菌毛或 者其主要亚单位FaeG、FedF的，免疫原组成单一。事实上，抗毒素抗体在抵抗ETEC感染过 程中同样起到重要作用。⑤没有把免疫原有效地传递给APC，也没有充分利用肠道的非特异 性免疫，无法激活更多的初始T细胞参与。基于上述原因，目前国内外研宄者都在寻求一种 更加安全和有效的可用于预防断奶仔猪腹泻的疫苗，以克服现有疫苗研宄中存在的缺点和 不足，其中，利用乳酸菌活载体构建的基因工程活载体疫苗被认为是一种前景的研宄方向。
[0004] 乳酸菌作为人和动物肠道主要的益生菌群之一，具有多种健康功效，诸如乳酸菌 能非特异性提高人和动物的胃肠道粘膜免疫功能，乳酸菌产生的乳酸菌素、细菌素、乳酸和 其它多种有机酸类具有抑菌、抗腹泻作用，在调节肠道菌群失调，增强肠道粘膜免疫功能， 预防肠道传染性疾病发挥重要作用；乳酸菌本身对黏膜有良好的黏附和肠道定植功能，并 且乳酸菌细胞壁的胞壁酰二肽亦具有免疫佐剂作用等。因此，乳酸菌可以作为表达外源抗 原的活载体，携带外源抗原基因的乳酸菌质粒可表达相应外源蛋白并能诱导特异性的局部 黏膜和系统免疫应答，这为利用乳酸菌进行异性的疾病预防奠定了重要的理论和实践基 础。但是，目前乳酸菌活载体疫苗研宄的一个局限就是对其遗传背景研宄减少，异源基因表 达量普遍较低，免疫原性较弱，免疫效果还比较差。如何提高异源基因表达量，尤其是抗原 的分泌表达量，提高免疫原性成为构建和设计乳酸菌活载体疫苗研宄的关键所在。
[0005] 迄今为止，还没有包含有引起断奶仔猪腹泻的ETECF4+的主要结构蛋白FaeG、 F18+受体结合域RBD、Stx2e毒素、STa毒素突变体、LT毒素B亚单位、STb毒素6种抗原的融 合基因的报道，也未见到同时使用靶向M细胞的分子肽C01、靶向肠道细胞的分子肽YadA31 两种靶向肽增强免疫应答的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一是提供一种优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序列，该 基因含有编码猪产肠毒素性大肠杆菌抗原F4+FaeG(V94E)、F18受体结合域RBD、Stx2e毒 素、STa毒素突变体、LT毒素B亚单位、STb毒素共计6种抗原以及靶向M细胞的分子肽C01、 靶向肠道细胞的分子肽YadA31的基因，各基因间由柔性肽GGGGSlinker连接而成。
[0007] 本发明的目的之二是提供一种含有并且能够高效表达上述基因的重组乳酸乳球 菌和重组大肠杆菌。
[0008] 本发明目的之三是将上述重组乳酸乳球菌和重组大肠杆菌应用于预防或治疗 ETEC引起的断奶仔猪腹泻。
[0009] 本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0010] 本发明的一种优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序列，含有编码猪产肠毒 素性大肠杆菌抗原FaeG、F18受体结合域RBD、Stx2e毒素、STa毒素突变体、LT毒素B亚单 位、STb毒素共计6种抗原以及靶向M细胞的分子肽C01、靶向肠道细胞的分子肽YadA31的 基因，各基因间由柔性肽GGGGS连接而成，所述多价抗原基因的核苷酸序列为SEQIDNO: 1 所示。
[0011] 进一步的，本发明还提出了一种产肠毒素性大肠杆菌多价抗原，其由SEQIDN0:1 所示的核苷酸序列编码。
[0012] 含有本发明所述的优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序列的宿主细胞也 在本发明的保护范围之内。
[0013] 其中，优选的，所述的宿主细胞为重组乳酸乳球菌或重组大肠杆菌。
[0014] 将SEQIDNO:1所示的碱基序列与乳酸乳球菌表达载体相连接，得到重组乳酸乳 球菌表达载体；将重组乳酸菌载体电转化导入宿主菌中即可筛选到得到一种重组乳酸乳球 菌，该重组乳酸菌可以分泌的形式表达上述基因所编码的抗原蛋白。该重组菌即可作为有 效活性成分制备基因工程活载体疫苗免疫仔猪。
[0015] 将SEQIDNO:1所示的碱基序列与大肠杆菌表达载体相连接，得到重组大肠杆菌 表达载体；将重组大肠杆菌表达载体转化到宿主菌BL21中，筛选，鉴定，即可得到能够高效 表达带有靶向分子的ETEC多价抗原的一种重组大肠杆菌。大量培养后，诱导表达，经纯化 即可获得表达上述基因所编码的抗原蛋白的包涵体蛋白。后者即可作为有效活性成分制备 基因工程亚单位疫苗免疫仔猪。
[0016] 再进一步的，本发明还提出了所述的优化的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原基因序 列在制备猪产肠毒素性大肠杆菌多价抗原或基因工程活载体疫苗中的应用。及
[0017] 所述的产肠毒素性大肠杆菌多价抗原在制备预防或治疗肠产毒性大肠杆菌引起 的断奶仔猪腹泻的药物中的用途。以及
[0018] 所述的宿主细胞在制备预防或治疗肠产毒性大肠杆菌引起的断奶仔猪腹泻的药 物中的用途。
[0019] 相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
[0020] 1、该基因涵盖了引起断奶仔猪腹泻ETEC中的以占据明显优势地位F4+、F18+ETEC 负责黏附的菌毛关键部位和四种最为常见的毒素基因，其表达产物诱导产生的抗体不但 可以抵抗F4+、F18+ETEC黏附，中和其产生的毒素，还可以中和其他非F4+、F18+ETEC产生的 Stx2e毒素、STa毒素、LT毒素、STb毒素，将会诱导产生更加广泛的、更加全面的保护性应 答反应。
[0021] 2、优化的双靶向型ETEC多价抗原编码基因在重组乳酸乳球菌中的表达量提高， 并且以分泌形式表达目的蛋白量得到明显提高。表达的蛋白也具有良好的抗原性。
[0022] 3、用本发明制备的重组乳酸菌免疫动物，具有良好的免疫原性，口服动物可以诱 导产生特异性体液免疫和细胞免疫应答，也可产生局部黏膜免疫应答。靶向分子具有提高 免疫效果的作用，并且这两个靶向分子具有协同增强免疫应答的能力。本发明制备的重组 乳酸菌可以作为基因工程活载体疫苗使用。
[0023] 4、优化的双靶向型ETEC多价抗原编码基因插入大肠杆菌表达载体，导入宿主菌 后，依然能够实现重组融合蛋白的大量表达，表达的蛋白具有抗原性；用本发明所制备的 重组大肠杆菌表达所得的包涵体直接作为活性成分免疫动物，就可以诱导动物产生免疫应 答，同样具有良好的免疫原性，同时靶向分子具有提高免疫效果的作用。该包涵体可以作为 基因工程亚单位疫苗使用。
[0024] 5、采用本发明重组蛋白以包涵体形式用作基因工程亚单位疫苗经口服、滴鼻、肌 肉注射等途径，或者以重组乳酸乳球菌用作基因工程活载体疫苗经口服、滴鼻等途径，用于 预防断奶仔猪F4+、F18+ETEC感染，能够有效的保护仔猪抵抗至少2X101(ICFUETEC攻击，疫 苗免疫后产生的免疫应答可以缩短感染猪的排毒时间，对减少猪场内感染机会，猪群快速 恢复健康状态具有重要意义。此外，口服免疫乳酸菌活载体疫苗还可以提高和改善试验猪 攻毒后的平均日增重。
[0025] 6、本发明的制备方法简单，生产成本低廉。
【附图说明】
[0026] 图1为基因组织结构不意图；
[0027] 图2为基因点突变引起的亲水性变化分析；
[0028] 图3为pNZ8112载体图谱；
[0029] 图4为重组乳酸乳球菌培养上清（a)与菌体（b)中表达目的蛋白的westernBlot 鉴定图；
[0030] 其中泳道1蛋白分子量标准；2含PNZ8112载体的重组乳酸乳球菌诱导后培养上 清（a)与菌体（b) ;3pNZ8112-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb/NZ9000 诱导后培养上清 (a)与菌体（b) ;4pNZ8112-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-col/NZ9000 诱导后培养上 清（a)与菌体（b) ;5pNZ8112-mFaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-col-YadA31/NZ9000 诱 导后培养上清（a)与菌体（b) ;6pNZ8112-FaeG-F18RBD-Stx2e-STa-LTB-STb-col-YadA31/ NZ9000诱导后培养上清（a)与菌体（b)
[0031] 图5是优化的基因在重组大肠杆菌中表达的SDS-PAGE电泳图；
[0032] 其中泳道1蛋白分