同时制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及茶多酚中儿茶素的分离纯化方法，尤其是涉及一种利用大孔吸附树脂 结合琼脂凝胶微球键合e-CD介质从茶多酚中同时制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸 酯和表儿茶素没食子酸酯的方法。
【背景技术】
[0002] 茶多酚是茶叶中主要的活性之一，其成分主要是儿茶素类物质，约占60%? 80%，而其中EGCG含量最高，约占儿茶素的50%?60%，ECG其次，约占10%?20%。EGCG 具备抗菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、修复电离辐射造成的皮肤损伤、降血脂、降血糖、抗癌、 抑制心血管疾病等众多生活活性特征，引起国内外学者的广泛兴趣，而研宄表明，ECG也具 备众多生物活性，如抗菌、抗癌、抑制动脉硬化、调节心律等。
[0003] 目前制备EGCG和ECG方法有化学合成和天然产物提取，而化学合成的步骤繁琐， 产率低，不适合工业化生产；在天然产物提取方面，主要有沉淀法、溶剂萃取法以及柱色谱 等方法，沉淀法带来的金属离子残留和溶剂萃取法中的有机溶剂残留等问题，难以达到保 健食品和医药质量标准，因此柱色谱方法比较普遍，其报道的方法，如大孔吸附树脂、硅胶、 聚酰胺、C-18反相柱、Sephadex LH-20等柱层析方法，但目前存在的缺陷在于单凭某一种方 法难以制备较高纯度，或高纯度条件下产物回收率低。如中国专利CN102702163 B中得到 茶多酚精品后，通过离子络合沉淀，过滤，酸转溶，大孔树脂吸附得到儿茶素，然后儿茶素经 过两次大孔吸附树脂纯化，得到纯度98%以上的EGCG单步收率50 %左右，工艺流程非常繁 琐；中国专利CN101643466 B中茶多酚经过乙酸乙酯萃取两次，合并有机相后浓缩得到浸 膏，浸膏水溶解液先后通过聚酰胺和大孔吸附树脂吸附解析，解析液在此浓缩得到浸膏，高 浓度纯水溶解后，加晶种结晶24h，其步骤繁琐，收率也仅约为30%。中国专利CN 1199965 C中用S印hadex LH-20 -步纯化，其整个过程柱色谱参数难以放大；专利CN1193994C中用 丙酮、氯仿等溶剂在氮气保护下反复结晶后通过Sephadex LH-20纯化，步骤繁琐，难以连贯 进行放大生产。专利CN101921253B中用膜技术得到高纯度的EGCG，但整个过程也需要借助 萃取，树脂层析，高浓度结晶。CN 102276570 B中C-18键合硅胶反相柱得到高纯度EGCG， 但也需要借助SMB色谱技术，其虽然能够工艺流程连贯，但成本高。CN102964329B中也是通 过高聚合物反相柱层析得到高纯度EGCG，但是反相填料较为昂贵，投入成本较高。徐军等利 用寡聚环糊精配基键合介质分离EGCG(利用寡聚环糊精配基键合介质分离表没食子儿茶 素没食子酸酯的新方法，化工进展，2005(24)，1171-1175)，其介质用琼脂糖作为材料基质， 成本较高，而且负载量较小。
[0004] 由于EGCG和ECG化学性质较为相似，茶多酚精制几乎都是以EGCG为目标产物，而 将ECG作为杂质予以去除，这样造成资源浪费。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的旨在提供一种回收率高、整个工艺过程成本低、污染小的同时制备 高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯的方法。
[0006] 本发明包括以下步骤：
[0007] 1)用水溶解茶多酚，过滤后，得到澄清的茶多酚水溶液；
[0008] 2)利用弱极性大孔吸附树脂对步骤1)得到的茶多酚水溶液进行吸附，再通过梯 度洗脱，分别得到富含EGCG馏分、EGCG与ECG重叠馏分、富含ECG馏分；
[0009] 3)将步骤2)得到的富含EGCG馏分通过琼脂凝胶微球键合e -⑶（简称AG- e -⑶） 介质进行柱层析，以80%乙醇为流动相进行洗脱，EGCG纯度高于95%时，收率高于85% ;
[0010] 4)将步骤2)得到的EGCG与ECG重叠馏分，通过纯化水稀释，然后进行酒精计检 测，将醇浓度控制在< 10 %，重复步骤2);
[0011] 5)将步骤2)得到的富含ECG馏分通过琼脂凝胶微球键合e -⑶（简称AG- e -⑶） 介质进行柱层析，以80%乙醇为流动相进行洗脱，ECG纯度高于90%时，收率高于80% ;
[0012] 6)将步骤3)和5)所得产物分别减压浓缩除醇后，进行冷冻干燥，分别得到高纯度 表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯。
[0013] 在步骤1)中，所述水可采用纯化水；所述茶多酚水溶液中按质量百分比 EGCG 彡 30%，ECG 彡 10%。
[0014] 在步骤2)中，所述弱极性大孔吸附树脂可采用HPD450树脂、AB-8树脂、D180树 脂等中的一种，优选AB-8树脂；所述通过梯度洗脱可通过10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、 40 %乙醇和50 %乙醇梯度洗脱，每个梯度流动相洗脱体积可控制在1?3BV，洗脱流速可 为0. 8?2. OBV/h ;优选每个梯度流动相洗脱体积为2BV，洗脱流速为1. 5BV/h ;流动相为乙 醇-水二元流动相。
[0015] 在步骤3)中，所述柱层析的上柱原液与树脂之间的承载量可为30?40g/L，优选 35g/L，其中，上柱原液以茶多酚含量计算，树脂以柱体积计算；所述柱层析的上柱原液的相 关物质的色谱纯度要求为EGCG彡40 %，ECG < 1 %，纯化介质的承载量可为5?7g/L，优选 6g/L，其中EGCG含量以质量计算，柱体积以体积计算；所述洗脱的流速可为2?3BV/h，优 选2. 5BV/h ;动相为乙醇-水二元流动相；所述琼脂凝胶微球键合0 -⑶(AG- 0 -⑶）介质的 形状为圆球形，颗粒直径为50?200 ym，微球骨架为10%交联琼脂，功能基团为0 -⑶。
[0016] 在步骤4)中，所述EGCG与ECG重叠馏分，可循环通过AB-8树脂分离。
[0017] 在步骤5)中，所述柱层析的上柱原液的相关物质控制范围可为ECG多40%， EGCGS 1%。纯化介质的承载量可为3?5g/L，优选4g/L，其中，ECG含量以质量计算，柱 体积以体积计算；所述洗脱的流速可为2?3BV/h，优选2. 5BV/h，流动相为乙醇-水二元 流动相；所述琼脂凝胶微球键合0 -CD (AG-f3 -CD)介质的形状为圆球形，颗粒直径为50? 200 ym，微球骨架为10 %交联琼脂，功能基团为⑶。
[0018] 所制备的高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯可采用以下 方法进行色谱检测：
[0019]采用沃特世e296高效液相色谱系统，2998PDA紫外检测器，沃特世色谱柱， 250mmX 4. 6mm，填料为RP-C18硅胶柱，色谱柱温度为35°C，检测波长280nm，标准品为含量 98% EGCG和98% ECG (sigma公司），流动相A为甲醇，流动相B为0. 075 %冰醋酸水溶液， 洗脱方式为梯度洗脱，结果参见表1。
[0020]表 1
【主权项】
1. 同时制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯的方法，其特征 在于包括以下步骤： 1) 用水溶解茶多酚，过滤后，得到澄清的茶多酚水溶液； 2) 利用弱极性大孔吸附树脂对步骤1)得到的茶多酚水溶液进行吸附，再通过梯度洗 脱，分别得到富含EGCG馏分、EGCG与ECG重叠馏分、富含ECG馏分； 3) 将步骤2)得到的富含EGCG馏分通过琼脂凝胶微球键合β-CD介质进行柱层析，以 80%乙醇为流动相进行洗脱，EGCG纯度高于95%时，收率高于85% ; 4) 将步骤2)得到的EGCG与ECG重叠馏分，通过纯化水稀释，然后进行酒精计检测，将 醇浓度控制在< 10%，重复步骤2); 5) 将步骤2)得到的富含ECG馏分通过琼脂凝胶微球键合β -CD介质进行柱层析，以 80%乙醇为流动相进行洗脱，ECG纯度高于90%时，收率高于80% ; 6) 将步骤3)和5)所得产物分别减压浓缩除醇后，进行冷冻干燥，分别得到高纯度表没 食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯。
2. 如权利要求1所述同时制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子 酸酯的方法，其特征在于在步骤1)中，所述水采用纯化水；所述茶多酚水溶液中按质量百 分比 EGCG 彡 30%，ECG 彡 10%。
3. 如权利要求1所述同时制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子 酸酯的方法，其特征在于在步骤2)中，所述弱极性大孔吸附树脂采用HPD450树脂、AB-8树 月旨、D180树脂中的一种，优选AB-8树脂。
4. 如权利要求1所述同时制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子 酸酯的方法，其特征在于在步骤2)中，所述通过梯度洗脱是通过10%乙醇、20%乙醇、30% 乙醇、40 %乙醇和50 %乙醇梯度洗脱，每个梯度流动相洗脱体积控制在1?3BV，洗脱流速 为0. 8?2. OBV/h ;优选每个梯度流动相洗脱体积为2BV，洗脱流速为I. 5BV/h ;流动相为乙 醇-水二元流动相。
5. 如权利要求1所述同时制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子 酸酯的方法，其特征在于在步骤3)中，所述柱层析的上柱原液与树脂之间的承载量为30? 40g/L，优选35g/L，其中，上柱原液以茶多酚含量计算，树脂以柱体积计算。
6. 如权利要求1所述同时制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子 酸酯的方法，其特征在于在步骤3)中，所述柱层析的上柱原液的相关物质的色谱纯度要求 为EGCG彡40 %，ECG < 1 %，纯化介质的承载量为5?7g/L，优选6g/L，其中EGCG含量以 质量计算，柱体积以体积计算；所述洗脱的流速可为2?3BV/h，优选2. 5BV/h ;流动相为乙 醇-水二元流动相。
7. 如权利要求1所述同时制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子 酸酯的方法，其特征在于在步骤4)中，所述EGCG与ECG重叠馏分的循环通过AB-8树脂分 离。
8. 如权利要求1所述同时制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食 子酸酯的方法，其特征在于在步骤5)中，所述柱层析的上柱原液的相关物质控制范围为 ECG彡40%，EGCG < 1 % ;纯化介质的承载量为3?5g/L，优选4g/L，其中，ECG含量以质量 计算，柱体积以体积计算。
9. 如权利要求1所述同时制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子 酸酯的方法，其特征在于在步骤5)中，所述洗脱的流速为2?3BV/h，优选2. 5BV/h，流动相 为乙醇-水二元流动相。
10. 如权利要求1所述同时制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子 酸酯的方法，其特征在于在步骤3)和5)中，所述琼脂凝胶微球键合β-CD介质的形状为圆 球形，颗粒直径为50?200 μ m，微球骨架为10%交联琼脂，功能基团为β -⑶。
【专利摘要】同时制备高纯度表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯的方法，涉及茶多酚中儿茶素的分离纯化方法。将茶多酚溶液通过弱极性大孔吸附树脂，乙醇-水二元梯度洗脱，得到富含EGCG馏分、EGCG与ECG重叠馏分、富含ECG馏分；富含EGCG馏分通过AG-β-CD介质柱层析，纯度95％以上的EGCG时回收率高于85％；富含ECG馏分同样用AG-β-CD柱层析，ECG纯度达到90％以上时的回收率为高于80％；EGCG与ECG重叠馏分循环通过同型号的大孔吸附树脂处理，继续分离富含EGCG馏分和富含ECG馏分。回收率高、产率高、分离介质价格低、无有毒溶剂、工艺简单。
【IPC分类】C07D311-62
【公开号】CN104592190
【申请号】CN201510083824
【发明人】石国宗, 吕述权, 赵坐都, 陈静, 张慧兰
【申请人】厦门蓝湾科技有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年2月16日