Her2基因扩增检测探针、试剂盒以及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及HER2基因扩增 检测探针、试剂盒以及方法。
【背景技术】
[0002] 人类HER-2/neu基因（Her-2基因）基因定位于染色体17q21，其编码产物为185kD 的跨膜精蛋白P185,由1255个氨基酸组成，720- 987位属于酪氨酸激酶区，其结构示意图 如图1所示。Her-2/neu蛋白是具有酪氨酸蛋白激酶活性跨膜慵蛋白，是EGFR家族成员之 一。Her-2/neu蛋白由胞外的配体结合区、单链跨膜区及胞内的蛋白酪氨酸激酶区三部分 组成，由于目前尚未发现能与Her-2/neu蛋白直接结合的配体.其主要通过与家族中其他 成员包括EGFR(HERVerbBI)，HER3/erbB3。HER4/erbB4形成异二聚体而与各自的配体结 合。Her-2/neu蛋白常为异二聚体首选伴侣，且活性常强于其它异二聚体。当与配体结合 后，主要通过引起受体二聚化及胞浆内酪氨酸激酶区的自身磷酸化.激活酪氨酸激酶的活 性。Her-2/neu蛋白在胃癌中的表达情况及影响因素 Her-2/neu蛋白通常只在胎儿时期表 达，成年以后只在极少数组织内低水平表达。然而在多种人类肿瘤中却过度表达，如乳腺 癌、卵巢癌、肺腺癌、原发性。肾细胞癌、子宫内膜癌等，并提示预后不良。荧光原位杂交的 方法检测乳腺癌细胞中Her-2/neu基因（17ql2)的扩增，作为判断预后以及乳腺癌药物治 疗，尤其是抗HER-2单克隆抗体（赫赛汀）靶向治疗的一项辅助检测手段。
[0003] 目前检测HER2基因的方法包括：免疫组织化学（IHC)法检测HER2蛋白过表达、荧 光原位杂交（FISH)法检测HER2基因拷贝数、酶联免疫吸附试验（ELISA)检测血清HER2E⑶ 或肿瘤组织P185。但病理常规工作中最实用的方法是IHC和FISH。IHC较FISH节约成本、 简单易行，但容易受到组织处理方法、固定时间等影响，其结果判断和解释存在较大的变 异，而FISH具有高度的重复性和可靠性。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的之一是HER2基因扩增检测试剂盒，该检测试剂盒可用于高特异性 和高准确性检测HER2基因扩增的情况。
[0005] 实现上述目的的技术方案如下。
[0006] HER2基因扩增检测试剂盒，包括有标记荧光染料的、针对HER2基因的第一组探针 和针对人类17号染色体着丝粒区域的第二组探针，所述第一组探针为选自SEQ ID NO. 41- SEQ ID NO. 50中的至少一条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中 的至少一条探针；上述两组探针所标记的荧光染料颜色不一样。
[0007] 在其中一个实施例中，所述第一组探针为选自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的 至少五条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少五条探针。
[0008] 在其中一个实施例中，所述第一组探针为选自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的 至少八条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少八条探针。
[0009] 在其中一个实施例中，所述第一组探针为SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50,所述第 二组探针为 SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60。
[0010] 在其中一个实施例中，所述SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50依次分别由以下引物扩 增制备得到：SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID NO. 20。
[0011] 在其中一个实施例中，所述SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60依次分别由以下引物扩 增制备得到：SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23和 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25 和 SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27 和 SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29 和 SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31 和 SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 33 和 SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35 和 SEQ ID NO. 36、 SEQ ID NO. 37 和 SEQ ID NO. 38、SEQ ID NO. 39 和 SEQ ID NO. 40。
[0012] 本发明的另一目的是提供一种HER2基因扩增检测探针。
[0013] 实现上述目的技术方案如下：
[0014] HER2基因扩增检测探针，针对HER2基因的第一组探针和针对人类17号染色体着 丝粒区域的第二组探针，所述第一组探针为选自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少一 条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的至少一条探针。
[0015] 在其中一个实施例中，所述第一组探针为选自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的 至少五条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少五条探针。
[0016] 本发明的另一目的是提供一种HER2基因扩增检测方法。
[0017] 实现上述目的的技术方案如下。
[0018] -种HER2基因扩增检测方法，包括
[0019] 待检测样品切片预处理；
[0020] 利用上述HER2基因扩增检测试剂盒进行杂交检测；
[0021] 复染后在显微镜下观察焚光信号。
[0022] 本发明的主要优点在于：
[0023] 1.本发明所提供的HER2基因扩增检测试剂盒的检测结果与Cytocell公司产品 HER2检测产品的吻合率高达100%。
[0024] 2.本发明制备的检测HER2基因扩增的FISH探针，不含有重复序列，能够避免交叉 反应，与染色体中HER2目标检测片段进行识别杂交，具有准确性高，特异性好、及假阳性低 的优点。
[0025] 3.本发明所述试剂盒的操作简单、安全，同时减少了 Cot-IDNA试剂、罗丹明抗-地 高辛抗体等昂贵试剂的使用，经济高效；
[0026] 4.与现有技术相比，本发明所述试剂盒的检测方法，无需使用Cot-IDNA对样本基 因进行封闭，操作方便，检测速度快，可在12-24小试内完成杂交检测实验。
【附图说明】
[0027] 图1为信号选择与计数指南示意图，其中，黑色点表示红色信号点；白色点表示绿 色信号点。
【具体实施方式】
[0028] 为了更好地理解本发明，下面结合附图、实施例进一步阐明本发明的内容，但本发 明的保护范围不局限于下面的实施例。
[0029] 实施例1
[0030] 本实施例所述的检测HER2基因扩增检测探针和试剂盒，其设计如下：
[0031] 一、设计扩增引物
[0032] 分别针对HER2基因和人类17号染色体着丝粒区域设计两组扩增引物，其中第一 组为针对HER2的扩增引物，第二组为针对人类17号染色体着丝粒区域的扩增引物，相应的 扩增产物分别组成了第一组探针库和第二组探针库。每组扩增引物得到的扩增产物能作为 重排的FISH探针，不含有重复序列，能够避免交叉反应，与染色体中HER2目标检测片段进 行特异性识别杂交。
[0033] 人工合成如下引物，扩增引物及其相应的扩增产物具体见表1(注：1F/1R为一 对引物，分别表示正向引物和反向引物；其他以此类推）。合成后的每条扩增引物分别用 10mmol/L Tris Buffer 配制成 100pmol/mL 的存液。
[0034] 表1扩增引物及扩增产物
[0035]
【主权项】
1. HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，包括有标记荧光染料的、针对HER2基因的 第一组探针和针对人类17号染色体着丝粒区域的第二组探针，所述第一组探针为选自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少一条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少一条探针；所述第一组探针与第二组探针所标记的荧光染料颜色不一 样。
2. 根据权利要求1所述的HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述第一组探针 为选自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少五条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少五条探针。
3. 根据权利要求2所述的HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述第一组探针 为选自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少八条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少八条探针。
4. 根据权利要求3所述的HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述第一组探针为 SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50,所述第二组探针为 SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50依次分别由以下引物扩增制备得到：SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID NO. 20。
6. 根据权利要求1-4任一项所述的HER2基因扩增检测试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60依次分别由以下引物扩增制备得到：SEQ ID NO. 21和SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25 和 SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27 和 SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29 和 SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31 和 SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 33 和 SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35 和 SEQ ID NO. 36、SEQ ID NO. 37 和 SEQ ID NO. 38、 SEQ ID NO. 39 和 SEQ ID NO. 40。 7. HER2基因扩增检测探针，其特征在于，针对HER2基因的第一组探针和针对人类17号 染色体着丝粒区域，所述第一组探针为选自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少一条探 针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的至少一条探针。
8. 根据权利要求7所述的HER2基因扩增检测探针，其特征在于，所述第一组探针为 选自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的至少五条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60中的至少五条探针。
9. 一种HER2基因扩增检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 待检测样品切片预处理； 利用权利要求1一6任一项所述HER2基因扩增检测试剂盒进行杂交检测； 复染后在显微镜下观察焚光信号。
【专利摘要】本发明公开了HER2基因扩增检测探针、试剂盒以及方法，包括有标记荧光染料的、针对HER2基因的第一组探针和针对人类17号染色体着丝粒区域的第二组探针，所述第一组探针为选自SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50中的至少一条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60中的至少一条探针；上述两组探针所标记的荧光染料颜色不一样。本发明所提供的HER2基因扩增检测试剂盒中的FISH探针，不含有重复序列，能够避免交叉反应，与染色体中HER2目标检测片段进行识别杂交，具有准确性高，特异性好、及假阳性低的优点。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104561361
【申请号】CN201510053892
【发明人】胡文晖, 吴诗扬, 廖传荣, 黄萌
【申请人】益善生物技术股份有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月30日