一种以番茄红素ε环化酶基因ILP标记对烟草制品进行鉴定的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学研宄领域，具体涉及一种以番茄红素 ε环化酶基因 ILP标 记对烟草制品进行鉴定的方法，其以烟草物种DNA的特异性作为鉴定依据，与传统鉴定方 法相比，具有更加客观、更加准确、更加可靠的优势。
【背景技术】
[0002] 烟丝很难从外观上进行鉴别检验，而以烟草特有的亚硝胺、烟碱等化学成分检测 来对烟丝进行检验又有如下局限：其一，烟碱并非烟草所独有，在其它茄科植物中也很常 见；其二，易被不法分子所采取的非法加料等手段所干扰。除此之外，上述法规要求检验人 员不仅需要掌握相关的原料特性、化学成分分析方法、感官评吸技术，还需具备烟叶生产和 分级技能，检验人员的培训难度大；另外，烟丝本身的霉变和不法分子所采取的染色等手 段，也加大了检验人员进行准确鉴定的难度。因此，依靠现有的检验方法对烟丝进行鉴别， 容易引起误判、错判的发生。
[0003] DNA分子标记技术属于分子生物学研宄范畴，是从DNA水平区分不同物种甚至 是同一物种不同个体之间的选择性标记技术。自上世纪80年代以来，随着聚合酶链式反 应（PCR)技术的出现，DNA分子生物学研宄发展迅猛，目前DNA分子标记技术已有数十 种之多，如限制性片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length polymorphism, RFLP)、随机扩增多态性标记（Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)、序列特异性 扩增区域标记（Sequence Characterized Amplified Regions, SCAR)、内含子长度多 态性标记（intron-length polymorphism, ILP)、单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP)、简单序列重复标记（Simple Sequence Repeats, SSR)等。以 DNA 分子 标记技术进行物种鉴定，是以物种的DNA分子多态性与其性状间的紧密因果关系为基础， 可内在、直接地反映物种的特性，以其进行物种鉴别，不受外界环境、检验人员主观感受差 异、加工条件及物种本身器官组织变化等因素的影响。大量研宄实践已经表明：在DNA分子 水平，不同物种间甚至是同一物种不同个体之间都能得到很好的区分。DNA分子标记技术作 为物种分类鉴定的一种手段，已被广泛地应用于属间、种间、品种间的分类鉴定和亲缘关系 研宄中，几乎可以对所有的生物种类进行分类鉴定，在目前物种鉴定技术中发展最快，也最 为热门。表1列出了 DNA分子标记技术在各类鉴定中的应用，目前尚未有采用DNA分子标 记技术对烟草制品进行鉴定的相关报道。
【主权项】
1. 一种以番茄红素 ε环化酶基因 ILP标记对烟草制品进行鉴定的方法，其特征在于， 提取待测样品的 DNA ;分别以 CTGATGTGTTGCTGTGCTAGG、AATGCACTTCGCAAGCTCTA 作为上下游 引物进行PCR扩增反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，在450 bp、550 bp位置处均出 现电泳条带，则判定样品为烟草制品。
2. 如权利要求1所述以番茄红素 ε环化酶基因 ILP标记对烟草制品进行鉴定的方法， 其特征在于，所述待测样品的DNA提取具体如下： 1)取待测样品碾磨成细粉末，放入2 mL离心管中； 2 )加入600~800 μ L、温度60 ± 5°C的CTAB提取缓冲液，混匀，每3~5min震荡2~5次 次，20min 后 12000 r/min 离心 10~15 min ; 3) 吸取上清液，分别加入与上清液体积相同的苯酷、氯仿，混勾，4°C、12000 r/min离心 10?15 min ； 4) 吸取上清液，加入等体积的氯仿，混勾，4°C、12000 r/min离心10?15 min，重复多次 至蛋白层不出现为止； 5) 取上清液，_20°C沉淀 l~2h，4°C、12000 r/min 离心 10~15 min ; 6) 弃去上清液，用50~70%乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥后，于-20°C或者_70°C保存 备用。
3. 如权利要求1所述以番茄红素 ε环化酶基因 ILP标记对烟草制品进行鉴定的方法， 其特征在于，所述PCR扩增反应条件为：解链温度95°C，30秒；退火温度55°C，30秒；延伸 温度68 °C，30秒；重复35个循环。
【专利摘要】本发明属于分子生物学研究领域，具体涉及一种以番茄红素ε环化酶基因ILP标记对烟草制品进行鉴定的方法，其采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取待测样品的DNA；分别以CTGATGTGTTGCTGTGCTAGG、AATGCACTTCGCAAGCTCTA作为上下游引物进行PCR扩增反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，在450bp、550bp位置处均出现电泳条带，则判定样品为烟草制品。与传统鉴定方法相比，本发明方法具有更加客观、更加准确、更加可靠等优点。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104561273
【申请号】CN201410779917
【发明人】刘楠, 张威, 罗安娜, 何声宝, 王英元, 冯晓民, 胡清源, 邢军
【申请人】国家烟草质量监督检验中心
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月17日