一种检测奶牛乳腺组织lncRNA基因芯片的设计方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和生物信息学交叉学科，特别涉及一种应用于奶牛乳腺组 织IncRNA表达的检测的基因芯片的设计方法。
【背景技术】
[0002] 长链非编码RNA (Long non-coding RNA，IncRNA)是长度大于200个核苷酸非编码 RNA，近几年成为备受瞩目的哺乳动物转录组重要成员。IncRNA能直接与染色质结合并募集 作用因子发挥其作用，又能参与组蛋白修饰、募集调控因子修饰抑制因子等达到基因沉默。 在转录前调控中，IncRNA通过与蛋白质相互作用参与转录水平的调控，如作为调控因子或 共调控因子通过形成转录起始复合体实现调控；在转录后的调控中，IncRNA主要通过与靶 基因的互补配对形成二聚体，掩盖与转录加工的位点，以此来调控转录后水平的剪切、拼接 和翻译等过程。IncRNA的调控作用在生理和疾病过程中扮演的重要角色逐渐引起人们广泛 的关注。
[0003] 随着高通量测序技术和生物信息学领域的迅猛发展，IncRNA在各领域的研宄已取 得了一定的进展，各物种已鉴定的IncRNA的数量逐渐增加，目前人、大鼠和小鼠已有商业 化的基因芯片，而其它物种只有依靠 RNA测度测序，并结合已知数据库查询等方法来进行 IncRNA研宄。在牛IncRNA研宄方面，已有数例相关报道，相关数据库中已确认的IncRNA也 较少，如ensembl数据库为797条，Billerey等（2014)报道了利木赞牛背最长肌584条基 因间IncRNA(IincRNAs)。另外，目前也无牛商业化的IncRNA芯片可供选择。鉴于目前和将 来有关IncRNA研宄发展的需要，急需一种成本相对较低且快速的IncRNA检测方法。而本 研宄设计的基于牛乳腺组织IncRNA基因芯片的设计方法，可以满足国内外市场有关牛乳 腺组织IncRNA的研宄，同时对牛其它组织器官IncRNA表达、功能等方面的研宄也有很好的 借鉴作用。
【发明内容】
[0004] 针对目前市场上并无商业化的可用于牛IncRNA研宄的基因芯片的问题，本发明 的目的是提供一种检测奶牛乳腺组织IncRNA基因芯片的设计方法，以满足对牛乳腺组织 IncRNA研宄的需要。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] 一种检测奶牛乳腺组织IncRNA基因芯片的设计方法，包括以下步骤：（1)以1头 正常泌乳奶牛和1头患有乳房炎奶牛为样本，取其乳腺组织，提取其总RNA，并混合；（2)混 合后的总RNA去核糖体RNA，再去含polyA的RNA，以去除大部分coding序列；（3)得到的 mRNA随机打断成为短片段，再以片断后的mRNA为模板，合成cDNA第一链，再合成cDNA第二 链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加 EB缓冲液洗脱经末端修复、加碱基A，加测序接头， 然后降解第二条链；(4)然后进行片段大小选择，进行PCR扩增，构建文库；（5)最后建好的 测序文库用 Illumina HiSeqTM 2000 进行测序；（6)然后获取 Clean reads、Cufflinks 重 构转录本、non-coding RNA库注释，和KEGG、NR、COG、SWISSPROT四个数据库进行蛋白库比 对，过滤和去除mRNA，最后经CPC预测，得到所需要的Long Chain Non-Coding RNA预测序 列结果文件；（7)在此基础上，根据牛编码蛋白质的基因序列（即mRNA)和IncRNA序列，开 发并设计同时检测奶牛乳腺组织IncRNA和mRNA的芯片。
[0007] 步骤⑶中，以片断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物合成cDNA第一链，并加 入缓冲液、dNTPs、RNase H 和 DNA polymerase I 合成 cDNA 第二链。
[0008] 步骤⑶中，通过UNG(Uracil-N-Glycosylase)酶降解第二条链。
[0009] 步骤（4)中，用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择。
[0010] 本发明的有益效果是：
[0011] 按照传统方法，对IncRNA和mRNA进行研宄时，需要分别进行转录组测序外加基因 表达谱芯片进行检测，这样每个样本的成本大概为3-4万元（按目前市场计算），分析测试 时间约为3个月。如引入本发明设计并开发的基因芯片，每个样本成本只需6000元，节约 成本3万元/样本左右，同时分析时间可缩短到20-30天以内。这样不仅节约了成本，且大 大缩短了分析时间，为科研人员赢得宝贵的时间。
[0012] 本发明的基于牛乳腺组织IncRNA基因芯片的设计方法，可以满足国内外市场有 关牛乳腺组织IncRNA的研宄，同时对牛其它组织器官IncRNA表达、功能等方面的研宄也有 很好的借鉴作用。
【附图说明】
[0013] 图1是本发明得到的芯片的杂交信号图；
[0014] 图2是利用本发明得到的芯片得到的6个样本聚类图。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步说明。
[0016] 一种检测奶牛乳腺组织IncRNA基因芯片的设计方法，以1头正常泌乳奶牛和1头 患有乳房炎奶牛为样本，取其乳腺组织，提取其总RNA，并混合；混合后的总RNA去核糖体 RNA，再去含polyA的RNA，以去除大部分coding序列；得到的mRNA随机打断成为短片段，再 以片断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物合成cDNA第一链，并加入缓冲液、dNTP S、RNase H和DNA polymerase I合成cDNA第二链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加 EB缓冲液洗 脱经末端修复、加碱基A，加测序接头，然后通过UNG(Uracil-N-Glycosylase)酶降解第二 条链；然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增，构建文库；最后建好的测 序文库用Illumina HiSeqTM 2000进行测序；然后获取Clean reads、Cufflinks重构转录 本、non-coding RNA库注释、和KEGG、NR、C0G和SWISSPROT四个数据库进行蛋白库比对，过 滤和去除mRNA，最后经CPC预测，得到所需要的Long Chain Non-Coding RNA预测序列结果 文件；在此基础上，根据牛编码蛋白质的基因序列（即mRNA)和IncRNA序列，开发并设计同 时检测奶牛乳腺组织IncRNA和mRNA的芯片。
[0017] 名词解释：
[0018] polyA :多聚腺苷酸，通常位于mRNA上的150-200个腺苷酸残基。
[0019] dNTPs :三磷酸碱基脱氧核苷酸。
[0020] RNase H :Ribonuclease H，中文名为核糖核酸酶 Η。
[0021] DNA polymerase I :DNA 聚合酶 I 〇
[0022] UNG酶：Uracil-N-Glycosylase酶，中文名为尿喃啶-N-糖基化酶。
[0023] 利用本专利设计并开发的芯片，得到芯片杂交信号图和6个样本聚类分析图分别 如图1和图2所示。
[0024] 具体设计文件如表1-3 :
[0025] 表 1
【主权项】
1. 一种检测奶牛乳腺组织IncRNA基因芯片的设计方法，其特征在于：包括以下步骤： (1)以1头正常泌乳奶牛和1头患有乳房炎奶牛为样本，取其乳腺组织，提取其总RNA，并 混合；（2)混合后的总RNA去核糖体RNA，再去含polyA的RNA，以去除大部分coding序列； (3)得到的mRNA随机打断成为短片段，再以片断后的mRNA为模板，合成cDNA第一链，再合 成cDNA第二链，经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加 EB缓冲液洗脱经末端修复、加碱基A， 加测序接头，然后降解第二条链；(4)然后进行片段大小选择，进行PCR扩增，构建文库；（5) 最后建好的测序文库用Illumina HiSeqTM 2000进行测序；（6)然后获取Clean reads、 Cuff links重构转录本、non-coding RNA库注释，和1^66、顺、〇?、31133?1?01'四个数据库进 行蛋白库比对，过滤和去除mRNA，最后经CPC预测，得到所需要的Long Chain Non-Coding RNA预测序列结果文件；（7)在此基础上，根据牛编码蛋白质的基因序列和IncRNA序列，开 发并设计同时检测奶牛乳腺组织IncRNA和mRNA的芯片。
2. 如权利要求1所述的检测奶牛乳腺组织IncRNA基因芯片的设计方法，其特征在于： 步骤（3)中，以片断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物合成cDNA第一链，并加入缓冲液、 dNTPs、RNase H 和 DNA polymerase I 合成 cDNA 第二链。
3. 如权利要求1所述的检测奶牛乳腺组织IncRNA基因芯片的设计方法，其特征在于： 步骤（3)中，通过UNG酶降解第二条链。
4. 如权利要求1所述的检测奶牛乳腺组织IncRNA基因芯片的设计方法，其特征在于： 步骤（4)中，用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择。
【专利摘要】本发明提供了一种检测奶牛乳腺组织lncRNA基因芯片的设计方法，以1头正常泌乳奶牛和1头患有乳房炎奶牛为样本，取其乳腺组织，提取其总RNA，并混合；去核糖体RNA，再去含polyA的RNA；得到的mRNA随机打断成为短片段，合成cDNA第一链、cDNA第二链，洗脱经末端修复、加碱基A，加测序接头，降解第二条链；进行片段大小选择，PCR扩增，构建文库；建好的测序文库进行测序；然后获取Clean？reads、Cufflinks重构转录本、non-coding？RNA库注释，进行蛋白库比对，过滤和去除mRNA，经CPC预测，得到Long？Chain？Non-Coding？RNA预测序列结果文件；根据牛编码蛋白质的基因序列和lncRNA序列，开发并设计同时检测奶牛乳腺组织lncRNA和mRNA的芯片。可以满足有关牛乳腺组织lncRNA的研究，对牛其它组织器官lncRNA表达、功能等方面的研究也有借鉴作用。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104561261
【申请号】CN201410629821
【发明人】毛永江, 朱小瑞, 邢世宇, 李锐, 杨章平
【申请人】扬州大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年11月10日