一种利用赤霉菌制备3β，7α，15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法
【技术领域】
[0001] 本发明留体化合物生物转化方法具体的设计一种羟化方法。
【背景技术】
[0002] 屈螺酮是一种新型的孕激素，因其具有一定的盐皮质激素作用，在用于制备口服 短效避孕药时，可以克服一般孕激素带来的体重增加的副作用。3 β，7α，15 α -三羟基 雄甾-5-烯-17-酮（即7α，15α -二羟基去氢表雄酮，简称7α，15α -diOH-DHEA，CAS : 2963-69-1)则是生产屈螺酮的重要中间体，因合成困难，一般采用或去氢表雄酮（DHEA)生 物转化法生产。
[0003] 中国专利CN102965288A公开了一种用于将DHEA转化为3β，7α，15α -三羟基雄 留-5_ 稀-17-酮的赤霉菌（Gibberellaintermedia) CA3-1 (保藏编号为 CGMCC No. 4903)， 可以实现高浓度投料与高产物得率，其在常规发酵工艺下，投料浓度达到5-8g/L，底物转化 率达到68-84%，且随着投料浓度提高，其底物转化率出现了显著的降低，当投料浓度达到 8g/L时，转化率仅有68%。
[0004] 因此在采用赤霉菌将DHEA转化为3 β，7α，15 α -三羟基雄甾-5-烯-17-酮的生 物发酵中，进一步优化发酵条件，提高底物的转化率和投料浓度，成为现有技术中亟待解决 的问题
【发明内容】
[0005] 为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种改进的利用赤霉菌制备3β，7α， 15 α-三羟基雄留-5-烯-17-酮的方法，在研宄中为我们惊奇的发现，现有技术中通常被用 作抑菌剂的某种壳聚糖衍生物，能够意外的提高赤霉菌发酵制备3 β，7 α，15 α -三羟基雄 甾-5-烯-17-酮时的转化率和投料浓度。
[0006] 本发明提供了 一种利用赤霉菌（Gibberella intermedia) CA3-1 制备 3 β，7 α， 15 α -三羟基雄留-5-烯-17-酮的方法，所述赤霉菌保藏编号为CGMCC No. 4903,所述方法 包括以下步骤：
[0007] (1)菌体培养液的制备，将保藏号为CGMCC No. 4903的赤霉菌（Gibberella intermedia) CA3-1作为生产菌种，经斜面培养、菌体培养得到菌体培养液；
[0008] (2)生物转化，向步骤（1)中的菌体培养液中加入富马酰壳聚糖和DHEA，富马酰壳 聚糖与菌体培养液的重量体积比为1 : 50?100, DHEA的终浓度为8. 5?10g/L，在26? 30°C下，200?220r/min的搅拌转速下转化36?60h，即得转化液；
[0009] (3)产物提取，将转化液用乙酸乙酯提取浓缩，得到3 β，7α，15 α-三羟基雄 甾-5-烯-17-酮。
[0010] 所述的富马酰壳聚糖的取代度为〇. 45?0. 48。
[0011] 所述的方法，其特征是斜面培养的培养基为PDA培养基，其组成为成分及配比为： 土豆淀粉200?500g/L ;葡萄糖30?50g/L ;酵母粉5?lOg/L ;琼脂粉15?20g/L以及 余量的蒸馏水；
[0012] 所述的方法，其特征是所述用于菌体培养的培养基为菌体培养基，所述菌体培养 基的成分及配比为：葡萄糖20?50g/L ;NaCl 0· 5?2g/L ;酵母粉10?30g/L ;K2HP04 0· 1?5. Og/L ;FeS04 · 7H20 0· 01?0· lg/L ;及余量的蒸馏水，调培养基的pH至6· 5-7. 5。
[0013] 所述的方法，其特征是所述菌体培养液的制备工艺为：
[0014] 斜面培养，将接种菌种的培养基斜面置于28-32?，培养3-5天，得到成熟的孢子 菌丝，菌体培养分为一次培养和二次培养两步；
[0015] -次培养，用接种环挑斜面培养得到的一环菌丝接种于有80?120mL菌体培养基 中，在26?30°C下震荡培养18-36h得到一次培养液；
[0016] 二次培养，将一次培养液以体积百分比3-6%的接种量接入菌体培养基中，以与一 次培养相同的条件继续培养18_36h，得到菌体培养液。
[0017] 所述的方法，其特征是依发酵规模不同，二次培养可以分多次进行。每次接种均采 用上一次培养得到的培养液，接种量为体积百分比3-6%，用于生产菌体培养液。
[0018] 壳聚糖（chitosan)又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的几丁质（chitin) 经过脱乙酰作用得到的，壳聚糖具有一定增溶作用，但因其也具有抑菌作用，因此一般不在 生物发酵领域使用，参考文献一一壳聚糖的化学改性及其衍生物的抑菌活性研宄（冯永巍， 江南大学博士论文，2011年6月）中公开了对壳聚糖进行化学改性得到的苯甲酰壳聚糖、 对羟基苯甲酰壳聚糖、富马酰壳聚糖等壳聚糖衍生物，我们经过实验惊奇的发现，富马酰壳 聚糖在用于本发明所提及的赤霉菌羟化发酵时时，能够显著的提高底物的投料浓度和转化 率，而壳聚糖及其他壳聚糖衍生物均无此效果。而且对于采用其他菌种进行羟化发酵时，加 入富马酰壳聚糖也无此作用。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施例用于 说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0020] 菌种：赤霉菌（Gibberella intermedia) CA3-1，保藏编号 CGMCC No. 4903
[0021] 底物原料：去氢表雄酮（DHEA)，含量98%，
[0022] 富马酰壳聚糖、对羟基苯甲酰壳聚糖、苯甲酰壳聚糖均按参考文献一一壳聚糖的 化学改性及其衍生物的抑菌活性研宄（冯永巍，江南大学博士论文，2011年6月）中公开 的方法制备得到，其中富马酰壳聚糖的取代度为〇. 45?0. 48,苯甲酰壳聚糖的取代度为 1. 2-1. 3,对羟基苯甲酰壳聚糖的取代度为1. 2-1. 3,壳聚糖的脱乙酰度>大于90%。
[0023] PDA培养基的配比为：土豆淀粉300g/L ;葡萄糖40g/L ;酵母粉7g/L ;琼脂粉17g/ L以及余量的蒸馏水；pH自然，在121°C高压蒸汽下灭菌20min。
[0024] 菌体培养基的配比为：葡萄糖35g/L;NaCl 0.9g/L;酵母粉15g/L;K2HP04 0.2g/ L ;FeS04 ·7Η20 0· 05g/L ;灭菌前调培养基的pH至6· 5_7· 5,在121°C高压蒸汽下灭菌20min。
[0025] 步骤
[0026] (1)将实验室_80°C保存的菌种甘油管，加入到IOmL的菌体培养基进行活化培养。 再转接到置于250mL锥形瓶中的30mL菌体培养基中，培养2天得种子液，
[0027] 斜面培养，将该种子液划线于PDA培养基，将接种菌种的PDA斜面置于30°C的恒温 培养箱中，培养4天，得到成熟的孢子菌丝；
[0028] -次培养，用接种环挑一环斜面培养得到的菌丝接种于装有IOOmL菌体培养基的 500mL摇瓶中，在28°C，220rpm摇床上培养24h，得一次培养液；
[0029] 二次培养，将一次培养液以体积百分比4%的接种量接入菌体培养基中，以与一次 培养相同条件继续培养20小时，得到菌体培养液；
[0030] 3)将去氢表雄酮及壳聚糖或其衍生物投入到菌体培养液中，去氢表雄酮的投料浓 度为Ag/L，壳聚糖或其衍生物的投料浓度为Bg/L，相同条件下转化60小时放瓶。乙酸乙酯 提取转化液中的产物进行HPLC分析，计算DHEA转化为7 α，15 a -diOH-DHEA的转化率为
[0031]
【主权项】
1. 一种利用赤霉菌（Gibberella intermedia) CA3-1 制备 3 β，7 α，15 α -三轻基雄 甾-5-烯-17-酮的方法，所述赤霉菌保藏编号为CGMCC No. 4903,其特征是所述方法包括以 下步骤： (1) 菌体培养液的制备，将保藏号为CGMCC No. 4903的赤霉菌（Gibberella intermedia) CA3-1作为生产菌种，经斜面培养、菌体培养得到菌体培养液； (2) 生物转化，向步骤（1)中的菌体培养液中加入富马酰壳聚糖和DHEA，富马酰壳聚糖 与菌体培养液的重量体积比为1 : 50?100, DHEA的终浓度为8.5?10g/L，在26?30°C 下，200?220r/min的搅拌转速下转化36?60h，即得转化液； (3) 产物提取，将转化液用乙酸乙酯提取浓缩，得到3β，7α，15α-三羟基雄 甾-5-烯-17-酮。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征是所述的富马酰壳聚糖的取代度为0. 45?0. 48。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征是斜面培养的培养基为PDA培养基，其组成为成 分及配比为：土豆淀粉200?500g/L ;葡萄糖30?50g/L ;酵母粉5?10g/L ;琼脂粉15? 20g/L以及余量的蒸馏水； 所述用于菌体培养的培养基为菌体培养基，所述菌体培养基的成分及配比为：葡萄 糖 20 ?50g/L ;NaCl 0· 5 ?2g/L ;酵母粉 10 ?30g/L ;Κ2ΗΡ040· 1 ?5. Og/L ;FeS04 · 7 H2OO. 01?0. lg/L ;及余量的蒸馏水，调培养基的pH至6. 5-7. 5。
4. 如权利要求1?3任一所述的方法，其特征是所述菌体培养液的制备工艺为： 斜面培养，将接种菌种的培养基斜面置于28-32?，培养3-5天，得到成熟的孢子菌丝， 菌体培养分为一次培养和二次培养两步； 一次培养，用接种环挑斜面培养得到的一环菌丝接种于有80?120mL菌体培养基中， 在26?30°C下震荡培养18-36h得到一次培养液； 二次培养，将一次培养液以体积百分比3-6%的接种量接入菌体培养基中，以与一次培 养相同的条件继续培养18_36h，得到菌体培养液。
【专利摘要】一种利用赤霉菌制备3β，7α，15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法，其特征是所述方法包括以下步骤：(1)菌体培养液的制备，将保藏号为CGMCC？No.4903的赤霉菌(Gibberella？intermedia)CA3-1作为生产菌种，经斜面培养、菌体培养得到菌体培养液；(2)生物转化，向步骤(1)中的菌体培养液中加入富马酰壳聚糖和DHEA，富马酰壳聚糖与菌体培养液的重量体积比为1∶50～100，DHEA的终浓度为8.5～10g/L，在26～30℃下，200～220r/min的搅拌转速下转化36～60h，即得转化液；(3)产物提取，将转化液用乙酸乙酯提取浓缩，得到3β，7α，15α-三羟基雄甾-5-烯-17-酮。
【IPC分类】C12P33-06, C12R1-645, C12P33-12
【公开号】CN104561218
【申请号】CN201410624624
【发明人】张峥斌, 张汝金, 尹金玉, 高成华
【申请人】浙江仙居君业药业有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年11月9日