一种有效改善重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，涉及一种有效改善外源蛋白在大肠杆菌宿主中可溶性表达的方法。
【背景技术】
[0002]大肠杆菌表达系统是目前基因工程中最常用的重组蛋白表达系统.具有生长周期短、方法简便、构建快捷、表达水平高等优点，但由于大肠杆菌表达系统存在的缺陷，使所表达的蛋白常常易形成不溶性、无生物活性的包涵体。尽管可以通过后期变复性操作来获得蛋白的可溶性，过程复杂且收率低，显著增加了蛋白纯化的成本。为了获得有生物活性的重组蛋白表达产物，已有相关学者或研究人员摸索了许多方法来提高重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，提供了分子伴侣蛋白质、二硫键异构酶、脯氨酸异构酶等共表达方法或借助于金黄色葡萄球菌蛋白A、谷胱甘肽-S-转移酶、硫还原蛋白等融合标签可溶性表达或借助培养条件改变如降低诱导温度等方法，并已在生物工程、基因工程或分子生物学、遗传学等转基因表达中获得了大量应用，但对于一些蛋白而言，仍存在着过程复杂、操作繁琐、后期纯化成本高等问题。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供了一种简单有效、可防止包涵体产物形成的方法，能够丰富和增强研究人员提高外源基因可溶性表达的手段，具有操作简便、生产成本低以及可规模放大的特点。
[0004]本发明采用以下技术方案:
O种子活化:将-80°C冻存的重组蛋白大肠杆菌工程菌在无菌环境下按照0.1%的接种量及根据具体的宿主及载体情况加入相应量的抗生素，于36?38°C LB或其他培养基中150?220rpm摇床中培养过夜或12?14h。
[0005]2)发酵罐接种:在火焰保护下，按照I?10%的接种量接入种子液及加入相应量的抗生素进行菌体繁殖培养，温度32?38°C，pH控制在6.5?7.5，饱和溶氧浓度控制在10?50%。在后期可通过流加补料方式来延长发酵周期及提高菌体生长量。
[0006]3)诱导表达:当快要达到诱导阶段时，间断补料持续10?30分钟，通过含量测定确定培养基中C、N、P中的一种或数种限制性营养源消耗殆尽或低于控制水平之下时，开始进行温度变化或诱导剂添加等方式进行重组蛋白的诱导表达。后续通过控制营养源与其他补料成分分开流加的方式进行补料。此阶段维持2?36小时。注意其他营养源应按照菌体营养需求正常流加，中间可通过过程含量测定来改进配方。
[0007]4)收获菌体:5000 rpm离心5?20 min,去除上清，收集菌体，置于-20°C保存。
[0008]本方法主要通过后期控制与蛋白合成有关的营养源补料流加的方式来减慢蛋白合成的速度，从而改善重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。
[0009]所述诱导表达阶段的补料可为合成培养基、半合成培养基、复合培养基，优选为全合成培养基，必要时可加入微量元素进行补充，如为半合成培养基、复合培养基，其天然有机物中所含的限制性营养源应注意在内。
[0010]所述诱导表达阶段的补料应与菌体生长阶段补料应间断一段时间，促使培养基中的限制性营养源耗尽或低于后期控制水平以下，间隔时间优选为10?30分钟，优选为采用含量检测来控制。
[0011]所述改善重组蛋白在大肠杆菌表达体系中可溶性表达的方法，可与其他已知的改善可溶性表达的方法如融合标签、分子伴侣以及培养条件改变等组合使用。
【具体实施方式】
[0012]结合具体实施例进行说明。
[0013]实施例1
菌株:E.coli ILlO BL21(DE3)PET15b 工程菌(自主购建)；
培养基:LB液体培养基
摇瓶配制:按照LB配方(氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L)，将各种试剂称好后，加入相应量的三级水，使其溶解并调节PH至7.0，分装摇瓶50ml /瓶(250ml)，在高压灭菌锅内121° C20min灭菌。
[0014]1L发酵罐培养基配制:按照6L量根据LB配方称好各种试剂，加入相应量的三级水，加入发酵罐中，并采取在线灭菌的方式于121° C 20min灭菌后降温至37 °C备用。
[0015]菌体生长阶段补料配制:按照胰蛋白胨50 g/L，酵母浸粉25 g/L配制I升，混合后在高压灭菌锅内121° C20min灭菌后备用。
[0016]菌体诱导表达阶段补料配制:按照葡萄糖100 g/L，配制500ml，硝酸铵50 g/L、3水磷酸氢二钾14 8/1，磷酸二氢钾5.2 g/L，混合配制500ml，在高压灭菌锅内121° C20min灭菌后备用。
[0017]一级种子制备:将-80° C冻存的重组蛋白大肠杆菌工程菌在无菌环境下按照0.1%的接种量及终浓度50ug/ml的卡那霉素，于LB培养基中37°C，200rpm培养过夜。
[0018]发酵罐接种及菌体生长:在火焰保护下，按5%的量加入300ml制备的种子及终浓度为50ug/ml的卡那霉素，在线采用质量百分比20%的氨水调节pH值至7.0，然后在37°C，pH为7.0，溶氧控制在30%左右的饱和溶氧浓度，进行菌体生长培养。当溶氧升至50%后，则需流加补料。
[0019]对照样诱导表达:当菌体密度0D600达到时22时，直接加入终浓度为0.2mM IPTG进行诱导表达，补料配方及流加控制如生长阶段，诱导10小时后取样5000 rpm离心10 min作为对照样。
[0020]本发明方法诱导表达:当菌体密度0D600达到时22时，停止流加补料，继续培养30min后，取样测定发酵液中还原糖含量，余样作诱导前空白样，当还原糖低至0.05%时，力口入终浓度为0.2mM诱导剂IPTG，流加葡萄糖，控制还原糖浓度在0.1%左右。期间每间隔30min流加30ml/次混合非C源补料。诱导10小时后结束。
[0021]收获菌体:5000 rpm离心10 min,收集菌体。
[0022]样品处理与检测:称取2.5g各个样品菌体加入10ml 20 mM Tris-HCl, pH8.0破菌缓冲液，搅拌10?20 min使之混合均匀，超声破碎在400W功率下，采取超声条件总时间10分钟，开启2秒，关闭2秒破碎菌体。完毕后在破菌液中取出20ul作为全蛋白样品，剩余破菌液于4°C，12000rpm下离心1min,作为可溶性蛋白样品，经过处理后进行SDS-PAGE检验，通过bandscan软件扫描，由结果可知，重组蛋白可溶性表达比对照样提高了 50%。
[0023]实施例2
菌株:E.coli ILlO BL21(DE3)PET15b工程菌(本公司自主购建);
培养基:2YT液体培养基(氯化钠5g/L，蛋白胨16g/L，酵母浸粉10g/L)
摇瓶配制:按照2YT配方，将各种试剂称好后，加入相应量的三级水，使其溶解并调节PH至7.0，分装摇瓶50ml /瓶(250ml)，在高压灭菌锅内121° C 20min灭菌。
[0024]1L发酵罐培养基配制:按照6L量根据2YT配方称好各种试剂，采用三级水定容至6L，加入发酵罐中，并采取在线灭菌的方式于121° C 20min灭菌后降温至37 °C备用。
[0025]菌体生长阶段补料配制:按照胰蛋白胨50 g/L，酵母浸粉25 g/L配制I升，混合后在高压灭菌锅内121° C20min灭菌后备用。
[0026]菌体诱导表达阶段补料配制:按照硝酸铵100 g/L,配制500ml，葡萄糖100 g/L、3水磷酸氢二钾14 8/1，磷酸二氢钾5.2 g/L，混合配制500ml，在高压灭菌锅内121° C20min灭菌后备用。
[0027]—级种子制备:将-80° C冻存的重组蛋白大肠杆菌工程菌在无菌环境下按照0.1%的接种量及终浓度50ug/ml的卡那霉素，于LB培养基中37°C，200rpm培养过夜。
[0028]发酵罐接种及菌体生长:在火焰保护下，按5%的量加入300ml制备的种子及终浓度为50ug/ml的卡那霉素，在线采用质量百分比20%的氨水调节pH值至7.0，然后在37°C，pH为7.0，溶氧控制在30%左右的饱和溶氧浓度，进行菌体生长培养。当溶氧升至50%后，则需流加补料。
[0029]对照样诱导表达:当菌体密度0D600达到时22时，直接加入终浓度为0.2mM IPTG进行诱导表达，补料配方及流加控制如生长阶段，诱导6小时后取样5000 rpm离心10 min作为对照样。
[0030]本发明方法诱导表达:当菌体密度0D600达到时22时，停止流加补料，继续培养20min后，取样测定发酵液中氨基氮含量，余样作诱导前空白样，当氨基氮含量低至1%时，加入终浓度为0.2mM IPTG诱导，流加硝酸铵，控制氨基氮浓度在1%左右。期间每间隔30min流加30ml/次混合非N源补料。诱导6小时后结束。
[0031]收获菌体:5000 rpm离心10 min,收集菌体。
[0032]样品处理与检测:称取2.5g各个样品菌体加入10ml 20 mM Tris-HCl, pH8.0破菌缓冲液，搅拌10?20 min使之混合均匀，超声破碎在400W功率下，采取超声条件总时间10分钟，开启2秒，关闭2秒破碎菌体。完毕后在破菌液中取出20ul作为全蛋白样品，剩余破菌液于4°C，12000rpm下离心1min,作为可溶性蛋白样品，经过处理后进行SDS-PAGE检验，通过bandscan软件扫描，由结果可知，重组蛋白可溶性表达样比对照提高了 30%。
[0033]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种有效改善重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特征在于:大肠杆菌诱导后，通过后期补料中C、N、P营养源中一种或数种的供给来控制降低蛋白的合成速度，增加蛋白高级结构折叠的时间，从而实现改善蛋白可溶性表达的目的。
2.一种有效改善重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特征在于:在大肠杆菌高密度发酵时菌体增殖与蛋白诱导表达之间存在一个明显的补料供给间断期，以消耗完前期供给的丰富养份，从而过渡到后期营养可控的诱导表达补料供给阶段。
3.一种有效改善重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特征在于:此种方法可与其他公知的低温诱导表达、可溶性标签融合表达、分子伴侣共表达及培养基中后间添加一些可促进蛋白可溶性成份(如酒精、山梨醇等)的方法等一起组合使用。
4.根据权利要求1，后期补料中C、N、P营养源可以是合成培养基、半合成培养基或复合培养基成分，优选为合成培养基成分。
5.根据权利要求2，补料供给间期的长短，可通过饱和溶氧浓度变化情况及限制营养源含量检测方式来判定，优选为限制营养源含量检测方式。
【专利摘要】本发明公开了一种有效改善重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特点主要在于1.通过后期控制补料C、N、P营养源的供给速度来控制蛋白的合成速度。2.在菌体增殖与蛋白诱导表达阶段之间存在有一个明显补料间断期。3.可与蛋白低温表达、分子标侣共表达、标签融合表达等公知的提高重组蛋白可溶性表达的方法进行组合使用。此方法适用于生物工程、分子生物学、遗传学及基因工程等相关异源蛋白在大肠杆菌中表达的研究，能显著提高重组蛋白的可溶性表达。
【IPC分类】C12P21-02, C12R1-19
【公开号】CN104561200
【申请号】CN201310517277
【发明人】魏国祥, 杨雪宁, 郑春阳
【申请人】天津强微特生物科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月29日