一株能够利用木糖的酵母Candida jeffriesii的表达系统的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种能够利用木糖的酵母Candida jeffriesii的表达系统及其构建方法及应用。
【背景技术】
[0002] 在分子生物学、遗传学、生物化学、微生物学等学科发展的基础上，20世纪70年代 出现了基因工程技术。该技术通过体外将核酸分子插入质粒或其他载体分子，构成遗传物 质的新组合，并在导入宿主细胞后在新的遗传背景下得到稳定扩增和表达。功能基因的表 达对研宄其编码蛋白质结构与功能及其实际应用十分重要，其可置于不同表达系统中进行 表达。目前，已构建了多种用于基因功能研宄、蛋白表达等的表达系统，包括大肠杆菌表达 系统、酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。而能否使目的基因表达成功，取决于合适 的表达系统的选择。酵母是一种低等的单细胞真核生物，它既具有原核生物易于培养、繁殖 快、便于基因工程操作等特点，同时又具有真核生物蛋白质加工、折叠、翻译后修饰等功能。 因此，酵母现已成为现代分子生物学研宄最重要的工具和模型，特别适合表达真核生物基 因和制备有功能的蛋白质。
[0003] 木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源之一，可转化为清洁燃料乙醇、丁醇、大 宗化学品乳酸、高附加值产品木糖醇、有机酸类以及微生物菌体蛋白等多种生物基产品，甚 至可用于生产纤维素酶等多种工业用酶。其有效利用能够解决社会发展过程中所遇到的资 源缺乏问题，因而受到人们的广泛关注。木糖是木质纤维素水解产物中含量仅次于葡萄糖 的一种单糖，其高效率生物转化与利用是影响木质纤维素产业发展的关键因素之一。
[0004] 目前，已发现多种酵母能够利用甚至发酵木糖，其中研宄较多的有树干毕赤酵母、 休哈塔假丝酵母、嗜鞣管囊酵母等。经过多年的研宄，酵母利用木糖的代谢机制逐渐清晰， 相应遗传转化系统也在不断完善，使得基于基因表达、基因敲除等手段的基因工程技术在 该类酵母中的应用成为可能。一方面可通过构建工程菌提高底物如木糖的转化效率，增加 目标代谢产物产量；另一方面可通过构建工程菌使其能够以纤维质原料为底物生产重要 生物基产品如氨基酸、酶等。
[0005] Candida jeffriesii是新分离的能够利用木糖的酵母，系统发育分析表 明该酵母和另一株能够高效利用木糖的酵母Spathaspora passalidarum互成姐妹 群（NGUYEN N H，SUH S 0,MARSHALL C J，et al. Morphological and ecological similarities:wood-boring beetles associated with novel xylose-fermenting yeasts, Spathaspora passalidarum gen.sp. nov. and Candida jeffriesii sp.nov. Mycol Res, 2006, 110 (Pt 10) :1232-1241)。目前 Candida jeffriesii 基因水平上的研 宄尚处于起步阶段，急需一个可适用的遗传表达系统来进行更深入的研宄。尽管市面 上有多种应用于酿酒酵母、毕赤酵母等表达系统的表达载体，但该酵母属于利用木糖类 酵母，使用特殊的基因编码系统，密码子CUG编码丝氨酸而非亮氨酸（Wohlbach DJ, Kuo A,Sato TK,Potts KM, Salamov AA, Labutti KM, Sun H, Clum A, Pangilinan JL, Lindquist EA, Lucas S,Lapidus A, Jin M,Gunawan C, Balan V, Dale BE, Jeffries Tff, Zinkel R, Barry Kff, Grigoriev IV, Gasch AP. Comparative genomics of xylose-fermenting fungi for enhanced biofuel production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108 (32) :13212-13217.),因此上述常规表达载体很 难通过修饰来适用于该酵母表达系统中。
[0006] 因此，有必要构建适用于Candida jeffriesii自身的基因表达系统，在此基础上， 可采用该基因表达系统对Candida jeffriesii进行基因工程改造或在该表达系统基础上 挖掘Candida jeffriesii的优良基因信息，为构建新型酵母基因工程菌和筛选新型优良基 因，如纤维二糖酶基因等，奠定基础，同时通过基因工程手段使Candida jeffriesii利用木 糖转化生产人类有用产品，建立可再生资源循环利用的生物加工工艺成为可能。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一株能够利用木糖的酵母 Candida jeffriesii的表达系统。本发明的表达载体可实现在Candida jeffriesii中的 整合型稳定表达，对木糖利用酵母Candida jeffriesii的基础理论研宄及产品开发具有重 要的意义。
[0008] 本发明的技术方案如下：
[0009] 本发明一方面涉及一株能够利用木糖的酵母Candida jeffriesii的表达系统，包 括一种新型表达载体，其为环状，从5' -3'依次可操作性地连接有以下元件：
[0010] pMD19-Tsimple质粒骨架、rDNA同源重组序列、外源基因表达盒和筛选标记基因 表达盒；
[0011] 所述外源基因表达盒自上游至下游依次包括启动子、外源基因插入酶切位点以及 转录终止子；
[0012] 所述筛选标记基因表达盒包括启动子、抗生素抗性基因、转录终止子。
[0013] 所述能够利用木糖的酵母为Candida jeffriesii。
[0014] 所述的表达载体中的外源基因表达盒启动子和转录终止子的DNA序列来自酵母 Spathaspora passalidarum，该酵母全基因组序列在 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)中的编号为ΝΖ_ΑΕΙΚ00000000,其中所述酵母可为来自美国农业研宄菌种保藏中心 的细胞株NRRL Y-27907。
[0015] 优选的，所述的rDNA同源重组序列为18s rDNA，序列如SEQ ID NO: 1所示。另一个 选择是，所述的rDNA序列与SEQ ID N0:1的相似性不低于90%，优选为95%，更优为98%。
[0016] 所述外源基因表达盒中的启动子包括SpADHP、SpXYLp;转录终止子包括SpCYCl τ、 SpXYLT。
[0017] 所述筛选标记基因表达盒中的启动子包括SpTEFlp;抗生素抗性基因可以是表达 载体中常用的，包括潮霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、G418 ;转录终止子包括SpCYClT、 ScCYClT〇
[0018] 所述的SpADHp启动子为Spathaspora passalidarum来源的乙醇脱氢酶基因 ADHl 启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO: 2所示；
[0019] 所述的SpXYLp启动子为Spathaspora passalidarum来源的木糖还原酶基因 XYL 启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:3所示；
[0020] 所述的SpTEFlp启动子为Spathaspora passalidarum来源的转录起始因子基因 TEFl启动子，该启动子的DNA序列如SEQ ID NO:4所示；
[0021] 所述的SpCYClT终止子为Spathaspora passalidarum来源的细胞色素 C基因 CYCl 终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO: 5所示；
[0022] 所述的SpXYLT终止子为Spathaspora passalidarum来源的木糖还原酶基因 XYL 终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID N0:6所示。
[0023] 所述的ScCYCI1JS止子为Saccharomyces cerevisiae来源的细胞色素 C基因 CYCl 终止子，该终止子的DNA序列如SEQ ID NO: 7所示。
[0024] 所述外源基因的DNA片段可包括所述外源基因和筛选标记基因，所述外源基因插 入所述外源基因表达盒中启动子和转录终止子之间。在本发明的一个实施例中，所述外源 基因为gfp基因，该基因的DNA序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0025] 所述的筛选标记基因表达盒中可包括一个以上的标记基因，所述标记基因可为潮 霉素 B抗性基因、博来霉素抗性基因和/或G418;在本发明的一个实施方案中，所述标记基 因是潮霉素 B抗性基因。
[0026] 所述的潮霉素 B抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:8所示。
[0027] 所述的博来霉素抗性基因的DNA序列如SEQ ID NO:9所示。
[0028] 所述的G418的DNA序列如SEQ ID NO: 10所示。
[0029] 本发明所使用的酵母为一株能够利用木糖的酵母Candida jeffriesii。具体的， 该酵母购自美国农业研宄菌种保藏中心，保藏编号为NRRL Y-27738。
[0030] 具体而言，发明人按照下述技术方案制备得到了新型表达载体：
[0031] 以Spathaspora passalidarum基因组DNA为模板，以引物Pl和P2进行PCR扩 增获得18s rDNA同源重组序列；以引物P23和P24进行PCR扩增获得SpTEFlp启动子；以 引物P25和P26进行PCR扩增获得SpADHl p启动子；以引物P27和P28进行PCR扩增获得 SpXYLp启动子；以引物P29和P30进行PCR扩增获得SpCYCl^止子；以引物P31和P32进 行PCR扩增获得SpXYL t终止子。以PMD-hph m质粒DNA为模板，以引物P21和P22进行PCR 扩增获得片段hphm-ScCYClT。所述引物P1-P2的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13-14所示，所 述P21-P32的核苷酸序列如SEQ ID NO. 33-44所示。
[0032] 以pMD19-Tsimple为骨架，将上述各片段连接，所述连接是在适当的限制酶酶切 位点上进行的。具体连接方式为：在pMD19-Tsimple的EcoR V酶切位点连接18s rDNA后，沿 着18s rDNA的方向依次连接外源基因表达盒启动子、外源基因表达盒转录终止子、SpTEFlp 启动子、hph^-ScCYClp
[0033] 酵母基因表达调控是一个非常复杂的过程，选择合