一种源自假单胞菌的硫醚单加氧酶及其合成应用
【技术领域】
[0001] 一般地，本发明涉及生物催化与生物合成和分子生物学领域。具体地，本发明涉及 在生物催化与生物合成领域应用单加氧酶基因进行手性药物的合成。本发明还涉及单加氧 酶基因克隆及重组蛋白表达的方法。
【背景技术】
[0002] 手性亚砜类化合物是许多药物如抗肿瘤药Ustiloxin A、抗消炎药舒林酸，治疗胃 溃疡药奥美拉唑，抗菌素司帕索霉素等合成过程中的关键中间体，在药物合成中有非常广 泛的应用。目前，除了一些过渡金属催化剂如钛、钒能有效催化硫醚底物的不对称氧化反应 生成手性亚砜外，大多数化学催化剂在催化反应中还存在过度氧化、副产物多和反应条件 苛刻等不足，且这些化学催化反应体系通常使用重金属催化剂和过氧酸及双氧水等强氧化 齐IJ，不利于环境保护和可持续性发展的需求。而生物酶催化硫醚底物的不对称氧化反应可 以直接形成手性中心，是合成手性亚砜类化合物最方便直接的技术手段。另外，通过酶催化 硫醚底物氧化合成手性亚砜类化合物，还具有选择性高、环境友好等特点。鉴于此，生物催 化的硫醚不对称氧化反应可望发展成为工业化绿色制备手性亚砜类药物的新型生物制造 技术。但是，现有研究表明，具有高活性，高对映选择性和高底物耐受性的硫醚单加氧酶还 十分匮乏。无论是利用分离后的单加氧酶、产硫醚单加氧酶菌株，还是重组表达硫醚单加氧 酶的基因工程菌，催化效率都很低，无法满足绿色工业化生产的需求。因此，本发明的目的 是筛选和获得高活性单加氧酶用于手性亚砜类化合物的生物合成。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种单加氧酶及其在手性亚砜类化合物生物合成中的应用。
[0004] 本发明所提供的单加氧酶，来源于假单胞菌属?〇/?iei/ii CCTCC M2013683菌株，命名为PM0-3546,是如下1)或2)的蛋白质： 1) 由序列表中序列SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； SEQ ID No. 1、蛋白序列 MQTVEHEYKTIDPMALRRAFGTFVTGVTVVTTRDEQGSPRGMTANSFTSVSLDPALLLVCIGKGAASYPVF LQADSFAVNLLHEGQVALSNVFASKAPDKFDQVSHVAVHTGAPVLTDCLTWFDCTVHQCIDAGDHIILLGQVQAFG TSPEAPLGFCRGRYAQVKDPLPPGWLSASDMITGYLIESEGRLLLAEDGKGGWVLPTASRRLKDGRLPLSVGGEL ALLPDDTFLYSVFDTADNDPGYLIYRAKLAETLVEGALPPSLRFFALDQLPYSAIASHEIRAMLQRYARETERGS FGIYMDSQEGGRVAMVGSAQSffDKAY 2) 将序列表中序列SEQ ID No. 1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代 和/或缺失和/或添加且与序列SEQ ID No. 1所示蛋白具有相同活性的由1)衍生的蛋白 质。
[0005] 序列表中的序列SEQ ID No. 1由323个氨基酸残基组成。
[0006] 为了便于序列SEQ ID No. 1蛋白的纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序 列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0007] 表1标签的序列
【主权项】
1. 一种蛋白质，是如下1)或2)所示的蛋白质： 1) 由序列表中的SEQ ID No. 1的氣基酸残基序列组成的蛋白质； 2) 将序列表中的SEQ ID No. 1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有硫醚单加氧酶功能的由SEQ ID No. 1衍生的蛋白质。
2. 根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为具有硫醚单加氧酶功能 的蛋白质。
3. 权利要求1或2所述的蛋白的编码基因。
4. 根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如下1)、 或2)所示： 1) 序列表中SEQ ID No. 2的核苷酸序列； 2) 与序列表中SEQ ID No. 2的核苷酸序列具有90%以上的同源性；且编码的蛋白具有 硫醚单加氧酶功能的核苷酸序列。
5. 含有权利要求3所述的编码基因的重组表达载体、或含该重组表达载体的基因工程 菌。
6. 含有权利要求4所述的编码基因的重组表达载体、或含该重组表达载体的基因工程 菌。
7. 权利要求1所述的蛋白及其编码基因在手性亚砜类药物制备中的应用。
【专利摘要】本发明克隆表达并公开了一种来源于假单胞菌的单加氧酶PMO-6814及其应用。具体涉及从假单胞菌基因组中克隆单加氧酶PMO-6814的编码基因，并构建表达载体导入大肠杆菌内，得到的一种具有单加氧酶活性的基因工程菌。该单加氧酶蛋白的氨基酸序列如SEQ？ID？No.1所示，相应的编码基因核苷酸序列如SEQ？ID？No.2所示。该酶蛋白重组表达后能有效催化硫醚底物生成亚砜，具有较高的转化效率和立体异构对映选择性，可用于手性亚砜类药物的生物合成。
【IPC分类】C12N15-70, C12N9-02, C12N15-53, C12R1-38, C12N1-21, C12P11-00
【公开号】CN104560905
【申请号】CN201510029607
【发明人】杨加伟, 陈永正, 张红燕, 崔宝东, 韩文勇
【申请人】遵义医学院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月21日