一种快速提取水稻活性蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速提取水稻活性蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]蛋白质是一种复杂的有机化合物。蛋白质是由氨基酸分子呈线性排列所形成，相邻氨基酸残基的羧基和氨基通过肽键连接在一起。蛋白质的氨基酸序列是由对应基因所编码。除了遗传密码所编码的20种“标准”氨基酸，在蛋白质中，某些氨基酸残基还可以被翻译后修饰而发生化学结构的变化，从而对蛋白质进行激活或调控。蛋白质是生命的物质基础，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有水稻的生命水稻蛋白质的变性作用是蛋白质受物理或化学因素的影响，改变其分子内部结构和性质的作用。一般认为蛋白质的二级结构和三级结构有了改变或遭到破坏，都是变性的结果。能使蛋白质变性的化学方法有加强酸、强碱、重金属盐、尿素、丙酮等；能使蛋白质变性的物理方法有加热(高温)、紫外线及X射线照射、超声波、剧烈振荡或搅拌等。
[0003]水稻蛋白质变性会导致生物活性丧失。水稻蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、等生物学功能。生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。有时蛋白质的空间结构只要轻微变化即可引起生物活性的丧失。
[0004]目前，大多数的水稻蛋白质提取方法多采用丙酮等变性物质对蛋白进行提取，提取到的为水稻变性蛋白质。然而，有些研究需要采用水稻活性的蛋白质才能进行研究。因此，研发一种快速的提取水稻活性蛋白的方法显得非常重要。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种操作简便、适合大规模提取实验的快速提取水稻活性蛋白的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种快速提取水稻活性蛋白的方法，包括以下步骤:
O称取水稻根部样品，用液氮研磨水稻根部至粉末状，每Ig粉末加入l-2ml蛋白提取液，在旋涡混合器上震荡1-1 Omin，混合均匀，然后在4 °C，2000-5000g条件下离心10-30min,取一次上清液到无菌的1.5ml离心管中；
2)将上述含有一次上清液的离心管，在4°C，10000-20000g条件下离心10_30min，取二次上清液到无菌的1.5ml离心管中；
3)将上述含有二次上清液的离心管，在4°C，10000-20000g条件下离心10_30min，取三次上清液，所述三次上清液即为水稻活性蛋白；
所述蛋白提取液由终浓度为10-50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)^S浓度100-500 mmol /T, NaCl,终浓度2-5 mmol /I, ]\%012;体积分数0.1-1%乙基苯基聚乙二醇(NP-40 )和终浓度1-10 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)组成，pH=7_8。
[0006]本发明所述终浓度是指溶液在蛋白提取液中的浓度，例如所述蛋白提取液由终浓度为 10-50 mmol/L Tris-HCl，终浓度 100-500 mmol/L NaCl，终浓度 2-5 mmol/L MgCl2，体积分数0.1-1% NP-40和终浓度1-10 mmol/L DTT组成，pH=7_8，是指Tris-HCl在蛋白提取液中的浓度为10-50m mol/L, NaCl在蛋白提取液中的浓度为100_500m mol/L, MgCl2在蛋白提取液中的浓度为2-5m mol/L，NP-40在蛋白提取液中的体积分数为0.1_1%，DTT在蛋白提取液中的浓度为1-1Om mol/L，蛋白提取液的pH=7-8。
[0007]进一步，所述蛋白提取液由终浓度为20 mmol/L Tris-HCl，终浓度100 mmol/LNaCl，终浓度4 mmol/L MgCl2溶液；体积分数0.5% NP-40和终浓度5 mmol/L DTT组成，pH=7.5。
[0008]所述NP-40和DTT均购自上海碧云天生物技术有限公司。
[0009]本发明采用以上技术方案，采用独有的活性蛋白提取液，能够快速、便捷地提取到水稻的活性蛋白质。所述的蛋白提取液不含有变性裂解液，只含有NP-40和DTT等非变性裂解液，这些分子不会导致蛋白质变性，因此使得蛋白特别是膜蛋白保持天然状态。而变性的裂解液一般是加SDS，还有另外一些强的变性剂，它们能够使得蛋白完全变性。同时，本发明在提取过程中保持低温，因此能方便、快捷地提取到水稻的活性蛋白。本发明操作流程方便，适合大规模提取实验，便于实验室更好地开展水稻蛋白质组学的相关研究。
【附图说明】
[0010]图1为从水稻中提取出的活性蛋白的电泳图:
泳道I为蛋白质marker，泳道2为水稻活性蛋白。
【具体实施方式】
[0011]一种快速提取水稻活性蛋白的方法，包括以下步骤:
1)称取0.5-2g水稻根部样品，用液氮研磨水稻根部至粉末状(研磨至颜色泛白)，每g粉末加入l_2ml蛋白提取液，在旋涡混合器上震荡Ι-lOmin，混合均匀，然后在4°C，2000-5000g条件下离心10-30min,取一次上清液到无菌的1.5ml离心管中；
2)将上述含有一次上清液的离心管，在4°C，10000-20000g条件下离心10_30min，取二次上清液到无菌的1.5ml离心管中；
3)将上述含有二次上清液的离心管，在4°C，10000-20000g条件下离心10_30min，取三次上清液，所述三次上清液即为水稻活性蛋白；
所述蛋白提取液由终浓度为10-50 mmol/L Tris-HCl，终浓度100-500 mmol/L NaCl,终浓度2-5 mmol/L MgCl2溶液；体积分数0.1-1%乙基苯基聚乙二醇(NP-40 )和终浓度1-10 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)组成，pH=7_8。
[0012]所述NP-40和DTT均购自上海碧云天生物技术有限公司。
[0013]实施例1
一种快速提取水稻活性蛋白的方法，包括以下步骤:
1)称取Ig水稻根部样品，用液氮研磨水稻根部至粉末状(研磨至颜色泛白)，每g粉末加入Iml蛋白提取液，在旋涡混合器上震荡5min，混合均匀，然后在4°C，4000g条件下离心15min，取一次上清液到无菌的1.5ml离心管中；
2)将上述含有一次上清液的离心管，在4°C，20000g条件下离心30min，取二次上清液到无菌的1.5ml离心管中；
3)将上述含有二次上清液的离心管，在4°C，20000g条件下离心lOmin，取三次上清液，所述三次上清液即为水稻活性蛋白；
所述蛋白提取液由终浓度为20 mmol/L Tris-HCl，终浓度100mmol/L NaCl，终浓度4mmol/L MgCl2溶液；体积分数0.5%乙基苯基聚乙二醇(NP-40 )和终浓度5 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)组成，ρΗ=7.5。
[0014]所述ΝΡ-40和DTT均购自上海碧云天生物技术有限公司。
[0015]实施例2
一种快速提取水稻活性蛋白的方法，包括以下步骤:
1)称取0.5g水稻根部样品，用液氮研磨水稻根部至粉末状(研磨至颜色泛白)，每g粉末加入Iml蛋白提取液，在旋涡混合器上震荡lmin，混合均匀，然后在4°C，2000g条件下离心30min，取一次上清液到无菌的1.5ml离心管中；
2)将上述含有一次上清液的离心管，在4°C，1000g条件下离心30min，取二次上清液到无菌的1.5ml离心管中；
3)将上述含有二次上清液的离心管，在4°C，1000g条件下离心30min，取三次上清液，所述三次上清液即为水稻活性蛋白；
所述蛋白提取液由终浓度为10 mmol/L Tris-HCl，终浓度300 mmol/L NaCl，终浓度2mmol/L MgCl2溶液；体积分数0.1%乙基苯基聚乙二醇(NP-40 )和终浓度I mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)组成，pH=7。
[0016]所述NP-40和DTT均购自上海碧云天生物技术有限公司。
[0017]实施例3
一种快速提取水稻活性蛋白的方法，包括以下步骤:
1)称取2g水稻根部样品，用液氮研磨水稻根部至粉末状(研磨至颜色泛白)，每g粉末加入2ml蛋白提取液，在旋涡混合器上震荡lOmin，混合均匀，然后在4°C，5000g条件下离心lOmin，取一次上清液到无菌的1.5ml离心管中；
2)将上述含有一次上清液的离心管，在4°C，20000g条件下离心lOmin，取二次上清液到无菌的1.5ml离心管中；
3)将上述含有二次上清液的离心管，在4°C，20000g条件下离心lOmin，取三次上清液，所述三次上清液即为水稻活性蛋白；
所述蛋白提取液由终浓度为50 mmol/L Tris-HCl，终浓度500 mmol/L NaCl，终浓度5mmol/L MgCl2溶液；体积分数1%乙基苯基聚乙二醇(NP-40 )和终浓度10 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)组成，pH=8。
[0018]所述NP-40和DTT均购自上海碧云天生物技术有限公司。
[0019]按照实施例1的方法提取的水稻活性蛋白电泳图见图1，泳道I为Fermentas公司未预染蛋白Marker SM0431，泳道2为实施例1的方法提取的水稻活性蛋白。从图1可以看出，本方法能够方便、快捷地提取到水稻活性蛋白。
【主权项】
1.一种快速提取水稻活性蛋白的方法，其特征在于:其包括以下步骤: 1)称取水稻根部，用液氮研磨水稻根部至粉末状，每克粉末加入l-2ml蛋白提取液，在旋涡混合器上震荡Ι-lOmin，然后在4°C，2000-5000g条件下离心10_30min，取一次上清液到无菌的离心管中； 2)将上述含有一次上清液的离心管，在4°C，10000-20000g条件下离心10_30min，取二次上清液到无菌的离心管中； 3)将上述含有二次上清液的离心管，在4°C，10000-20000g条件下离心10_30min，取三次上清液，所述三次上清液即为水稻活性蛋白； 所述蛋白提取液由终浓度为10-50 mmol/L Tris-HCl，终浓度100-500 mmol/L NaCl,终浓度 2-5 mmol/L MgCl2，体积分数 0.1-1% NP-40 和终浓度 1-10 mmol/L DTT 组成，pH=7-8。
2.根据权利要求1所述的一种快速提取水稻活性蛋白的方法，其特征在于:所述蛋白提取液由终浓度为 20 mmol/L Tris-HCl，终浓度 100 mmol/L NaCl，终浓度 4 mmol/L MgCl2溶液，体积分数0.5% NP-40和终浓度5 mmol/L DTT组成，pH=7.5。
【专利摘要】本发明公开了一种快速提取水稻活性蛋白的方法，采用独有的活性蛋白提取液，所述的蛋白提取液不含有变性裂解液，只含有NP-40和DTT等非变性裂解液，不会导致蛋白质变性，因此使得蛋白特别是膜蛋白保持天然状态,同时，本发明在提取过程中保持低温，因此能方便、快捷地提取到水稻的活性蛋白。本发明操作流程方便，适合大规模提取实验，便于实验室更好地开展水稻蛋白质组学的相关研究。
【IPC分类】C07K1-14
【公开号】CN104558099
【申请号】CN201410835022
【发明人】王清水, 余彦
【申请人】福建师范大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月29日