一种人类尿液中pca3基因检测方法和引物的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及一种人类尿液中RNA提取和PCA3基因 检测的方法和引物。
【背景技术】
[0002] 前列腺癌是男性泌尿生殖系统中常见的恶性肿瘤之一，2012年我国肿瘤登记地区 前列腺癌发病率为9. 92/10万，列男性恶性肿瘤发病率的第6位。发病年龄在55岁前处于 较低水平，55岁后逐渐升高，发病率随着年龄的增长而增长，高峰年龄是70?80岁 [1]。
[0003] 目前临床主要应用血清前列腺癌特异性抗原（Prostatespecificantigen,PSA) 水平早期检测前列腺癌[2]。PSA是由前列腺上皮细胞所分泌的丝氨酸蛋白酶，其半衰期约 3. 15天。临床上常用的0?4ng/ml的PSA正常范围为标准筛选前列腺癌。但PSA只是前 列腺上皮细胞的标记物，而不是前列腺癌细胞的标记物。其在正常和癌变上皮细胞中都可 合成。除前列腺癌可引起PSA水平升高外，前列腺良性增生、前列腺炎性病变及梗死等均可 使其升高。因此PSA作为前列腺癌诊断标准的特异性不高，在确诊前列腺癌之前要经前列 腺穿刺病理检查，对组织进行病理活检 [3]。但前列腺穿刺为有创检查，可导致排尿困难、出 血、感染、血管迷走神经症状，严重者甚至死亡。而且，在所有血清PSA水平上升的男性中 仅有一少部分在穿刺活检后被诊断患有前列腺癌。相反，有些PSA水平在诊断临界值附近 (2. 5-4.g/L)的男性也有可能进展成前列腺癌[4]。随着人们生活方式、自然环境及社会 环境的改善，前列腺穿刺对中老年男性生活品质的影响越来越突出。因此，较血清PSA更为 准确、敏感的检测方法将有助于提高前列腺癌的诊断准确率，并降低活检造成的损伤。
[0004] 近年来发现前列腺癌基因3(Prostatecancergene3,PCA3)是已知的最具前列 腺癌特异性的标志物之一，对于前列腺癌的早期诊断及指导治疗具有十分重要的意义 [5]。 PCA3基因定位于第9号染色体上。PCA3全长约25kb，包含4个外显子和3个内含子。PCA3 是不编码蛋白质的非编码RNA。PCA3基因特异性地高表达于人类前列腺癌细胞和转移坏死 灶中，在正常前列腺、良性前列腺增生细胞中不表达或低表达。且PCA3mRNA的表达水平与 前列腺癌Gleason病理分级有关。目前已发现，PCA3在95%的前列腺癌患者中过度表达， 可从癌变前列腺细胞中无害测定，准确度接近100%。此外，在前列腺外组织中尚未检测到 PCA3转录，证明PCA3是目前已知前列腺癌最具特异性的肿瘤标志物。PCA3不受年龄，前列 腺体积或其他前列腺病（前列腺炎）的影响[6]。
[0005] 目前临床已开始尝试通过转录介导的核酸扩增实验（aprototype transcription-mediatedamplificationassay，APTIMA)方法，测定直肠指诊后收集的 尿液中PCA3mRNA/PSAmRNA的比值来计算PCASCORE，以早期检测前列腺癌[7]。这种将 PCA3mRNA/PSAmRNA比值用于诊断前列腺癌的方法较血清PSA检测方法具有更高的敏感性 和特异性。APTIMA方法检测PCA3mRNA/PSAmRNA比值用于前列腺癌诊断，其异性明显优于 PSA，可有效减少对前列腺穿刺活检的依赖，并能监测前列腺癌根治术后的前列腺癌复发。 但目该方法检测过程中使用的检测试剂和扩增引物具有很大的随意性，造成检测效率和可 靠性参差不齐。
【发明内容】
[0006] 本发明解决的技术问题就是，提供一种从受试者尿液中提取总RNA，并检测 PCA3mRNA和PSAmRNA的方法。通过测定PCA3mRNA/PSAmRNA比值，计算PCA3评分，以达到 早期诊断前列腺癌，尽量减少前列腺穿刺的目的。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一组特异性扩增PCA3mRNA和PSAmRNA的引物，包含 2组检测PCA3mRNA和PSAmRNA的PCR扩增核酸引物，长度为18-26bp，且分别特异性地扩 增出如SEQIDNO: 1所示的PCA3mRNA序列（部分）中第66位到148位核苷酸；如SEQID NO: 2所示的PSAmRNA序列（部分）中第101位到第165位核苷酸；
[0008] 用于扩增PCA3mRNA的核苷酸扩增引物如下：
【主权项】
1. 一组特异性扩增PCA3mRNA和PSA mRNA的引物，其特征在于：包含2组检测PCA3mRNA 和PSA mRNA的PCR扩增核酸引物，长度为18-26bp，且分别特异性地扩增出如SEQ ID N0:1 所示的PCA3mRNA部分序列中第66位到148位核苷酸；和如SEQ ID NO: 2所示的PSA mRNA 部分序列中第101位到第165位核苷酸； 用于扩增PCA3mRNA的核苷酸扩增引物如下： 正向引物：如SEQ ID NO:3所示； 反向引物：如SEQ ID N0:4所示； 荧光探针：如SEQ ID NO:5所示； 用于扩增PSA mRNA的核苷酸扩增引物如下： 正向引物：如SEQ ID N0:6所示； 反向引物：如SEQ ID NO:7所示； 荧光探针：如SEQ ID NO:8所示。
2. -种人类尿液中PCA3基因检测方法，其特征在于：使用权利要求1所述的引物对人 类尿液细胞总RNA进行荧光定量PCR反应，通过反应Ct值测定PCA3mRNA和PSA mRNA表达 水平。
3. 根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：包括步骤：尿液采集、保存、总RNA提 取、PCA3荧光定量PCR反应和结果分析。
4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：包括步骤： (1) 在初段尿液收集前列腺细胞； (2) 离心收集尿沉渣，并加入Trizol试剂保存； (3) 用氯仿，异丙醇方法提取前列腺细胞中总RNA，经乙醇洗涤，弃上清后干燥、溶解并 测定浓度； (4) 经过37°C逆转录反应1小时，合成cDNA ; (5) 用权利要求1所述的引物进行荧光定量PCR反应，通过反应Ct值测定PCA3mRNA和 PSA mRNA表达水平；根据公式PCA3评分=(PCA3mRNA/PSA mRNA)X 1000计算测试样品中 尿PCA3分数。
5. -种用于前列腺癌诊断的试剂盒，其特征在于：包含： (1) 收集含有前列腺细胞的尿沉渣的试剂和用具； (2) 尿液中总RNA提取试剂； (3) 检测PCA3和PSA基因表达的试剂，其中含有权利要求1所述的引物； (4) 样品中尿PCA3分数的计算公式：PCA3评分=(PCA3mRNA/PSA mRNA)X 1000。
【专利摘要】本发明涉及基因检测技术领域，是提供一种从受试者尿液中提取总RNA，并检测PCA3 mRNA和PSA mRNA的方法和特异性扩增PCA3 mRNA和PSA mRNA的引物，引物包含2组检测PCA3 mRNA和PSA mRNA的PCR扩增核酸引物，长度为18-26bp，且分别特异性地扩增出PCA3 mRNA片段和PSA mRNA片段。通过扩增结果，测定PCA3 mRNA/PSA mRNA比值，计算PCA3评分，以达到早期诊断前列腺癌，尽量减少前列腺穿刺的目的。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104531863
【申请号】CN201410808977
【发明人】钱学庆
【申请人】钱学庆
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月19日