一种阪崎肠杆菌的分子检测方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种阪崎肠杆菌的分子检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 阪崎肠杆菌saAazah'i)是肠杆菌属的一种条件性致病菌，在极 其微量的情况下都有致病性，该菌可导致婴幼儿(尤其是新生儿）脑膜炎、小肠结肠炎和败 血症，甚至遗留神经系统后遗症或导致死亡，死亡率高达20 %?50 %。尽管阪崎肠杆菌可 以从多种食品中检出，但在新生儿感染该菌事件的调查中发现婴儿配方奶粉是主要的感染 渠道。即使是婴儿配方奶粉中大肠菌群污染水平符合相应的微生物学标准，也可能存在阪 崎肠杆菌的污染。FA0/WH0在2004年召开了两次国际相关会议，倡导采用国际通用的分子 生物学方法来检测阪崎肠杆菌，以弥补传统方法的局限性。因此检测阪崎肠杆菌的方法是 否灵敏、特异及快速至关重要。目前对阪崎肠杆菌的检测方法主要有FDA推荐的传统检测 方法，免疫学方法和各种PCR方法。传统检测方法操作繁琐，检测时间长，而且灵敏度较低； 免疫学方法的特异性和灵敏度均较低；PCR方法敏感、准确、快速，可替代传统检测方法，但 由于需要昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程以及对检测人员较高的技术要求，而使其难以 普及和推广。近年来，阪崎肠杆菌的生化及分子检测方法取得重要进展，基于保守序列如 16SrRNA、23SrRNA以及16S- 23SrRNA间区序列（ITS)等，以及基于其特异性基因的 分子检测技术也相继建立。但是目前还没有建立一种稳定检测实际样品中阪崎肠杆菌的 分子分型技术。高旗利等(高旗利，张霞，罗茂凰等.奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法研 究[J].检验检疫科学，2005，15(4):4-8.)利用细菌16S和23SrDNA的保守区作为 通用引物，对6株阪崎肠杆菌16S~ 23SrDNA区间序列（ISR)进行了扩增和测序，建立 了奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法，奶粉样品中阪崎肠杆菌检测低限为2. 2~ 5. 4cfu/ 100g。Seo等（SeoKH,BrackettRE.Rapid,SpecificDetectionofEnterobacter sakazakiiinInfantFormulaUsingaReal-TimePCRAssay[J].JournalofFood Protection, 2005,68 (1): 59-63.)建立了阪崎肠杆菌实时荧光定量PCR方法，灵敏性 为100CFU/mLPBS，增菌后检测限可达到0.6CFU/g婴儿配方奶粉。张霞等（张霞，高旗 利，罗茂凰等.实时荧光PCR对奶粉中坂崎肠杆菌的检测[J].中国卫生检验杂志，2006， 16(2) : 214-241.)建立的实时荧光PCR方法检测灵敏度可达到1. 1CFU/100g。张朝 等(张朝；荧光定量PCR检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌研究[D];河北农业大学；2007 年）以阪崎肠杆菌的16SrRNA基因为靶基因，建立的加入内标荧光定量PCR检测婴儿配 方奶粉中阪崎肠杆菌的方法，灵敏度可以达到8. 624拷贝/yL，2. 7CFU/mL;人工污染检测 限可以达到14.117拷贝/^，3.50?"10(^婴儿配方奶粉。张宏伟等（张宏伟，于佳，郑 文杰等.利用环介导等温扩增技术对奶粉中阪崎肠杆菌进行检测[J].食品研究与开发， 2009, 30 (6) : 114-117.)建立的奶粉中阪崎肠杆菌中环介导等温扩增方法，检测低限为1. 2 CFU/100g〇
[0003]单引物等温扩增技术（Singleprimerisothermalamplification，SPIA)是近年 报道的一种新型线性核酸等温扩增技术。该技术具有操作设备简单、高忠实性、高效率和有 效防污染等优点。美国的NuGEN公司已经开发出专门用于RNA扩增的Ribo-SPIA相关产品。 Potash等成功应用Ribo-SPIA技术从生物样品中扩增全基因组cDNA对重组病毒EcoHIV感 染小鼠后感染应激基因表达情况进行研究。Whitworth等在分析猪胚胎不同发育阶段基因 表达差异时也应用了Ribo-SPIA技术进行mRNA的扩增和转录。目前应用较成熟的单引物等 温扩增技术均以病毒作为对象，其扩增后的检测方法为聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用此种方 法检出的灵敏度低，易产生沉淀，且结果假阳性高，尤其不适应于原核微生物的扩增检出。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种操作方便快速、灵敏度高、特异性强、检测 成本低的阪崎肠杆菌检测方法及其应用。
[0005] 本发明解决其技术问题采用的技术方案为： 一种阪崎肠杆菌的分子检测方法，其采用单引物等温扩增方法，以SYBERGreenII为荧 光染料，实时荧光检测仪检测扩增的实时荧光信号，即以实时荧光定量PCR检测扩增信号， 具体过程包括如下步骤： (1) 取含阪崎肠杆菌的待检样品，提取基因组DNA; (2) 建立阪崎肠杆菌的实时荧光单引物等温扩增的25yL反应体系： 其中RNA/DNA组合引物为 2. 8iimol/L、Blocker为 0? 2iimol/L、Mg2+ 为 5. 0mmol/L、dNTPs为 1. 0mmol/L、BSTDNA聚合酶为 20U、RNaseH酶为 2. 5U、RNaseInhibitor为 32U、SYBERGreenII为0. 3iiL，其余用灭菌DEPC水补足体系； 所述SYBERGreenII为300倍稀释； 将DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99°C，90s处理后降温至 60°C，迅速加入RNaseH和BstDNA聚合酶，在实时荧光定量PCR仪上55°C反应40min，反 应过程中实时监测荧光信号； (3) 检测分析：分析检测数据； 所述引物选用GGUCCGAC-TCACGAAAGCC5'端8nt碱基为RNA序列，3'端lint碱基为DNA序列；Blocker选用CGACGACCACGACA，3'端用生物素修饰，中间随机加上两个IXNA修 饰。
[0006] 优选的，所述IXNA包括A，C，G，T，U，mC六种城基中的一种。
[0007]优选的，步骤（1)所述提取DNA方法采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚法或 水洗法结合商业化试剂盒法。
[0008] 优选的，所述提取DNA方法采用商业化试剂盒法。
[0009] 本发明还提供所述检测方法在婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌检测中的应用。
[0010] 本发明所述XNA，即LNA，又称"锁核酸"（Lockednucleicacid，LNA)，是一种经过 修饰的类寡核苷酸衍生物，包括A，C，G，T，U，mC六种城基。XNA结构中P-D-呋喃核糖的 2' _0、4' -C位通过缩水作用形成刚性的结构。一般可见于A-DNA或RNA。
[0011] 本发明所述的普通热裂解法步骤如下： (1)取1mL菌液转入1. 5mLEppendorf离心管中5000-8000rpm，离心5min，弃上 清。
[0012] (2)加入200uL无菌DEPC水，振荡混匀，5000-8000rpm，离心5min，弃上清，重 复操作一次。
[0013] (3)加入 100uL无菌DEPC水，振荡混匀，100°C水浴 10min，12000rpm离心 10 min，取上清，-20 °C保存备用。
[0014] 本发明所述的蛋白酶K法步骤如下： ①将lmL培养液以12,000rpm，离心10分钟。弃去上清液，沉淀加蛋白酶K消化液 50?100iiL，混匀，55°C水浴1?3h。
[0015] ②加等体积的饱和酚抽提1?2次，再加等体积的氯仿/异戊醇（49 :1)抽提一次。
[0016] ③上清加1/10体积4°C预冷的3mol/LNaAC(pH5. 2)，加2. 5倍体积预冷的无 水乙醇或等体积的异丙醇，-20°C放置5?10min, 14,000rpm,离心15min。
[0017] ④小心吸弃或倒掉上清，沉淀加75%冰冷乙醇15,000rpm,离心5min洗漆1?2次。
[0018] ⑤弃去上清,室温干燥后加DEPC水50iiL溶解，_20°C保存备用。
[0019] 本发明所述的饱和酚提取法步骤如下： ①将lmL培养液以离心12000rpm，10min，收集菌体，加入裂解液50ML，100°C水浴15min，然后离心 12000rpm，10min。
[0020] ②取上清，加入等体积饱和酚混勻，室温15min,稍加振荡，4°C离心12000rpm, 30min，吸取上层水相，此水相反复用酚抽提二次后，吸水相加入0. 1mL，3mol/L醋酸钠 (pH5. 5)及0? 2mL20°C预冷的无水乙醇，混匀后放置于20°C，至少1h。
[0021] ③4°C离心12000rpm, 10min,小心倒去上清，加入灭菌DEPC水溶解DNA，_20°C 保存备用。
[0022] 本发明所述的商业化试剂盒法步骤如下： 选用天根细菌基因组DNA提取试剂盒，按试剂盒说明书进行基因组DNA的提取。
[0023] ⑴将lmL培养液10,OOOrpm，离心lmin，尽量吸净上清液。
[0024] ⑵向菌体沉淀中加入200W缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。
[0025] ⑶向管中加入20WProteinaseK溶液，混匀。
[0026] ⑷加入220W缓冲液GB，振荡15sec，70°C放置10min，溶液应变清亮，简短离心以 去除管盖内壁的水珠。
[0027] (5)加入220沿无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离 心以去除管盖内壁的水珠。
[0028] (6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中)，12,OOOrpm离心30sec，弃去收集管中的全部废液。将吸附柱CB3放回收集管中。
[0029] (7)向吸附柱CB3中加入500W缓冲液⑶（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,OOOrpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0030] ⑶向吸附柱CB3中加入600W漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,OOOrpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0031] ⑶重复操作步骤⑶