一种锁核酸增敏的检测mthfr基因c677t突变的探针及引物、试剂盒和检测方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T 突变的探针及引物、试剂盒和检测方法，适用于人体MTHFR基因C67H多态性位点的定性检 测。
【背景技术】：
[0002] 亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)是叶 酸代谢中的关键酶之一，可将还原型辅酶I(NADPH)相关的5, 10-亚甲基四氢叶酸还原为 5-甲基四氢叶酸。而5-甲基四氢叶酸是体内转移"碳基团"，包括甲基（-CH3)，甲酰基 (-CH0)、次甲基（-CH)等过程中起辅酶作用。MTHFR基因中C677T(SNPID:rsl801133)为该 基因影响功能的重要突变位点。研宄表明，C677T位点C变为T后，其编码的丙氨酸被缬氨酸 替代，纯合突变TT型MTHFR酶活性只有正常的30%，杂合突变CT型有正常酶活性的60%。 由于MTHFR酶活性的降低，导致了血液中5-甲基四氢叶酸的降低和同型半胱氨酸的堆积， 使得作为甲基供体的蛋氨酸合成障碍，最终引起DNA的甲基化水平异常，并会造成DNA链断 裂、染色体重组改变和染色体分离异常。因此MTHFR基因C677T位点的突变与一些妊娠并 发症有关，如胎儿神经管缺陷（NTD)，复发性流产，先兆子痫，胎盘剥离等有关。通过分析个 体MTHFR基因C67H位点的多态性，对提前采取预防措施，防止妊娠并发症具有指导意义。
[0003] 国家卫生计生委在2013年8月印发的《医疗机构临床检验项目目录（2013年版）》 中就明确了MTHFR(C677T)基因检测的医学意义。
[0004] 目前检测MTHFR基因C67H位点多态性的方法分为三类：传统Sanger测序法，聚 合酶链反应-限制性片段长度多态性技术（PCR-RFLP)、荧光定量PCR法（qPCR)，这三种方 法都是基于PCR技术。
[0005] 测序法：先进行PCR扩增，PCR扩增引物设计时使得待检的基因位点位于PCR产物 内，然后纯化PCR产物，再对其进行测序，根据测序峰图判读基因型。优点：结果准确，测序 法是基因多态性位点检测的金标准；缺点：成本较高，操作繁琐，需要凑齐一批样本才适合 开机检测。
[0006] PCR-RFLP技术：先进行PCR扩增，得到含有目的SNP位点的PCR产物，然后对PCR 产物进行酶切，电泳检测酶切条带，根据酶切条带进行判读。优点：成本低，结果比较直观； 缺点：电泳检测操作繁琐，污染的风险大。
[0007] qPCR法：qPCR的优点是操作简单，试验周期短，PCR产物无需进行后续分析即可判 断结果，因全过程在封闭的管内进行，减少了交叉污染。但是为了在一管qPCR中能同时区 分野生型、突变型和杂合型的基因多态性，在qPCR方法的引物和探针设计上衍生出不同的 策略；例如ARMS-PCR法：ARMS_PCR(amplificationrefractorymutationsystem)又叫等 位基因特异PCR，TaqDNA聚合酶缺少3' 一 5'外切酶活性，在一定条件下PCR引物3'末端 的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，分别设计突变引物、野生引物，2个引物 主要是3'末端碱基不同，通过qPCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。缺点： 区分基因不同等位位点只能通过引物序列3'末端的错配设计，特异性并不能保证，容易出 现假阳性。
[0008] TaqMan-MGB双探针法：常规的TaqMan探针一般长度在25个碱基，对于错配的区 分能力不强。MGB(Minorgroovebinder)分子能结合到杂交双链DNA的小沟中，在降低探 针长度的同时，仍然保证了DNA杂交双链较高的退火温度，因此3'端MGB分子修饰的探针检 测点突变的特异性会增加。MGB探针较一般TaqMan探针Tm值高10°C以上，长度只需12-15 碱基即可。但是MGB分子只能修饰在探针的3'端。一条探针只能修饰一个MGB探针，在检 测复杂的位点时，特异性还达不到完全区分突变和野生型的要求。
[0009] 而锁核酸（LNA-LockedNucleicAcid，简称LNA)是一种类寡核苷酸衍生物，结构 中含有一个或多个2'-0, 4'-C-亚甲基-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2'-0位和4'-C 位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环 形桥锁定了呋喃糖C3'-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部 结构的稳定性，由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很 好的识别能力和强大的亲和力。和MGB探针的作用类似，锁核酸修饰的TaqMan探针在降低 了探针的长度时，还能保持探针和DNA模板形成的杂交体保持较高的融解温度（Tm值），并 且由于LNA碱基可以在探针的任何位置进行修饰，因此在特异性方面具有很大的灵活性。
【发明内容】
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[0010] 本发明的第一个目的是提供一种锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探 针。本发明的锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针在合适的位置上进行锁核酸 修饰，以增加探针的特异性。
[0011] 本发明的锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针，其特征在于，所述的探 针序列如下：
[0012] 突变探针MTHFR677T:5' -荧光基团-CGGG+AG+T+CGAITT-淬灭基团；
[0013] 野生探针MTHFR677C:5' -荧光基团-CGGG+AG+C+CGAITT-淬灭基团；
[0014] 其中" + "表示3'端的碱基为锁核酸修饰碱基。
[0015] LNA修饰碱基不局限于上述三个碱基位置，但必须包括针对突变检测的碱基。
[0016] 所述的锁核酸修饰，其化学结构式如式I所示。
[0017]
【主权项】
1. 一种锁核酸增敏的检测MTHFR基因 C677T突变的探针，其特征在于，所述的探针序列 如下： 突变探针MTHFR 677T :5' -荧光基团-CGGG+AG+T+CGATTT-淬灭基团； 野生探针MTHFR 677C :5' -荧光基团-CGGG+AG+C+CGATTT-淬灭基团； 其中" + "表示3'端的碱基为锁核酸修饰碱基。
2. 根据权利要求1所述的锁核酸增敏的检测MTHFR基因 C677T突变的探针，其特征在 于，所述的锁核酸修饰，其化学结构式如式I所示：
3. 根据权利要求1所述的锁核酸增敏的检测MTHFR基因 C677T突变的探针，其特征在 于，所述的荧光基团为FAM、TET、VIC、HEX或ROX中的一种；所述的淬灭基团为能与荧光基 团配套的TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3基团中的一种。
4. 一种锁核酸增敏的检测MTHFR基因 C677T突变的引物，其特征在于，所述的引物其序 列如下： 上游引物 MTHFR 677F:5' -CCGAAGCAGGGAGCTTTG-3' ； 下游引物 MTHFR 677R: 5 ' -CGGTGCATGCCTTCACAA-3 '。
5. -种锁核酸增敏的检测MTHFR基因 C677T突变的检测试剂盒，包括含Mg2 +的PCR反 应缓冲液、dNTP混合物、Taq酶、ddH20、探针和引物，其特征在于，所述的探针为权利要求1 中所列的探针，所述的引物为权利要求4中所列的引物。
6. -种锁核酸增敏的检测MTHFR基因 C677T突变的检测方法，其特征在于，包括以下步 骤： ⑴、提取待测的样本基因组DNA ; (2)、采用权利要求1所列的探针和权利要求4所列的引物对步骤（1)得到的样本基因 组DNA进行荧光定量PCR扩增，测出野生型探针的Ct值和突变型探针的Ct值；设定Ct值 在小于35个循环数为检出阳性；则只有野生型探针检出阳性的样本为野生纯合型CC ;只有 突变型探针检出阳性的为突变纯合型TT ;而野生型探针和突变型探针都检出阳性的为CT 杂合子。
7. 根据权利要求6所述的锁核酸增敏的检测MTHFR基因 C677T突变的检测方法，其特 征在于，所述的荧光PCR扩增，其扩增反应体系为：含Mg2+的10XPCR反应缓冲液2.0yL、 2. 4 μ L 25mM MgCl2溶液、2. 5mM 的 dNTP 混合液 1. 6 μ L、5U/ul Taq 酶 0· 1 μ L、10 ?IOOng 的DNA模板1 μ L、20 μ M权利要求3所列的引物各0. 5 μ L、10 μ M权利要求1所列的探针各 0· 5 μ L，ddH20 12. 7 μ L，共计 20 μ Lo
8.根据权利要求6所述的锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的检测方法，其特 征在于，所述的荧光PCR扩增，其扩增反应条件优选为：94°C 3分钟变性和酶激活，94°C 30 秒变性，60°C 30秒退火，72°C 30分钟延长，循环45次。
【专利摘要】本发明公开一种锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针及引物、试剂盒和检测方法。本发明利用锁核酸能灵活修饰TaqMan探针的特点，在检测MTHFR基因C677T突变的探针的合适的位置上进行锁核酸修饰，以增加探针的特异性。采用上述锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针和引物对步骤(1)得到的样本基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，测出野生型探针的Ct值和突变型探针的Ct值；设定Ct值在小于35个循环数为检出阳性；则只有野生型探针检出阳性的样本为野生纯合型CC；只有突变型探针检出阳性的为突变纯合型TT；而野生型探针和突变型探针都检出阳性的为CT杂合子。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104531852
【申请号】CN201410767859
【发明人】张亮, 尹爱华, 麦明琴, 马健, 张彦
【申请人】广东省妇幼保健院
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月12日