抗河豚毒素单链抗体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗河豚毒素抗体，特别是涉及抗河豚毒素单链抗体及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 河豚毒素是一种钠离子通道抑制剂，通过阻止钠离子向胞外运输，破坏了细胞膜 两侧电位平衡，进而抑制神经和肌肉的电脉传导。河豚毒素中毒症状表现为肌肉麻痹、无法 自主呼吸，甚至窒息死亡（苏捷，姜琳琳，吴靖娜，等.动物携带河豚毒素的分子机制与 生态作用[J].南方水产科学，2013, 9(4) :99-104.)。在我国几乎每年都有河豚毒素中毒 甚至死亡的事件发生，因此研宄一种能快速中和人体内误食的河豚毒素的药物显得非常重 要。河豚毒素抗体可以与河豚毒素进行有效中和，从而降低河豚毒素的毒性，减缓河豚毒素 对机体的损伤。但是完整抗体的相对分子质量较大，体内应用时难以穿越血管进入靶部位。 对抗体基因重组，表达由抗体重链V区与轻链V区间通过人工合成的连接肽连接而成的抗 体称为单链抗体（SingleChainFragmentVariable，scFV)，其相对分子质量仅为完整抗 体的1/6。单链抗体相对分子质量小，容易通过血管壁，容易穿透实体瘤，是导向药物首选的 载体；单链抗体无可结晶区域片段（Fragmentcrystallizableregion,Fc)，免疫原性弱， 不与非祀细胞的Fc受体结合，不易引起超敏反应和排斥反应。单链抗体可通过包涵体大量 表达，易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白，是目前研宄最多的小分子抗体。
【发明内容】
[0003] 本发明的第一目的在于提供大肠杆菌（Escherichiacoli)DH5 a B10。
[0004] 本发明的第二目的在于提供抗河豚毒素单链抗体及其制备方法。
[0005] 大肠杆菌（Escherichiacoli)DH5aB10,已于2014年11月27日保藏于中国典型 培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072,保藏中心保藏编号为CCTCC NO：M2014597〇
[0006] 所述抗河豚毒素单链抗体的氨基酸序列为：
[0007]
【主权项】
1. 大肠杆菌（Escherichia coli)DH5 α B10,已于2014年11月27日保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为CCTCC NO !M2014597。
2. 抗河豚毒素单链抗体，其特征在于其氨基酸序列为：
其中第1?438位核苷酸为抗河豚毒素单链抗体的轻链可变区基因，全长为438bp ;第 439?483位核苷酸为连接肽Linker，全长45bp ;第484?858位核苷酸为为抗河豚毒素 单链抗体的重链可变区基因，全长为375bp。
4.抗河豚毒素单链抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 克隆抗河豚毒素单链抗体基因，并将其导入载体，构建重组载体； 2) 将重组载体导入宿主细菌，构建表达抗河豚毒素单链抗体的重组工程菌； 3) 将重组工程菌发酵培养，分离纯化发酵液，即得抗河豚毒素单链抗体。
5. 如权利要求4所述抗河豚毒素单链抗体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述 克隆抗河豚毒素单链抗体基因的模板来自抗河豚毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株大肠杆 菌（Escherichia coli)DH5a BlO0
6. 如权利要求4所述抗河豚毒素单链抗体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述 克隆抗河豚毒素单链抗体基因是分别克隆抗河豚毒素单链抗体重链可变区基因和抗河豚 毒素单链抗体轻链可变区基因，再通过连接肽Linker将两者连接。
7. 如权利要求6所述抗河豚毒素单链抗体的制备方法，其特征在于所述克隆抗河豚毒 素单链抗体重链可变区基因的引物为： 5' 端引物：5'-TCG GGT GGC GGT GGA TCC GGC GGT GGC GGT TCG SAG GTS MAR CTK SAG SAG TCff GG-3'； 3' 端引物：5'-AAG CTT CTC GAG TGM RGA GAC DGT GAC CGT GG-3'。
8. 如权利要求6所述抗河豚毒素单链抗体的制备方法，其特征在于所述克隆抗河豚毒 素单链抗体轻链可变区基因的引物为： 5' 端引物：：5'-ATC CAT GCC ATG GAC ATT SffG MTS ACM CAG WCT CCA-3'； 3' 端引物：：5'-GCC GGA TCC ACC GCC ACC CGA GCC ACC GCC ACC CCG TTT YAT YTC CAR CTT-3" 〇
9. 如权利要求4所述抗河豚毒素单链抗体的制备方法，其特征在于在步骤I)中，所述 克隆抗河豚毒素单链抗体表达载体引物为： 5' 端引物:5, -GAA TTC GGA CAT TGA GCT GAC ACA GTC TCC-3' ； 3' 端引物:5' -CTC GAG TGC GGA GAC AGT GTC ATC ACA ATG-3' ； 所述载体可为PET-22M+)质粒。
10. 如权利要求4所述抗河豚毒素单链抗体的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述 宿主细菌为 E. coli BL21(DE3); 在步骤3)中，所述纯化可采用亲和层析。
【专利摘要】抗河豚毒素单链抗体及其制备方法，涉及抗河豚毒素抗体。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5αB10，保藏编号为CCTCC NO：M2014597。克隆抗河豚毒素单链抗体基因，导入载体，构建重组载体，再导入宿主细菌，构建表达抗河豚毒素单链抗体的重组工程菌；将重组工程菌发酵培养，分离纯化发酵液，即得。利用抗河豚毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株大肠杆菌(Escherichia coli)DH5αB10，通过RT-PCR技术，获得该抗体的重、轻链可变区序列，组装成抗河豚毒素单链抗体基因，并构建重组表达载体pET-22(b+)-scFv，进行抗河豚毒素单链抗体的表达、纯化与鉴定。CCTCC NO：M201459720141127
【IPC分类】C12N1-20, C07K1-22, C07K16-18, C12N15-70, C12R1-19
【公开号】CN104531568
【申请号】CN201410769063
【发明人】苏捷, 刘智禹, 姜琳琳, 吴靖娜, 王茵
【申请人】福建省水产研究所
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月12日