专利名称:由原生质体再生稻株的方法
本发明叙述一种用所谓原生质体法形成稻株的方法。更确切地说本发明讲的是一种由原生质体衍生出愈伤组织，再由它再生出稻株的方法，原生质体则来自于由稻种的胚、盾片或胚根产生的愈伤组织。
原生质体是植物、细菌、真菌之类的除去了细胞壁的细胞。因为原生质体没有细胞壁，故易于经受人工处理，例如细胞融合、基因控制、以及人为的体细胞突变等。于是，如果能由所处理的原生质体再生出一个完全的植株，则可能获得一种植物，它具有野生植物所没有的优点。作为发展这种所谓的原生质体法的第一步，对于所要研究的每个具体的有机体，都必须建立能够由原生质体再生出完全植株的方法。
对于双子叶植物，例如烟草，已知有一些方法可用来从原生质体中再生出完全的植株。在这方面常用的方法包括将原生质体埋置在半固态的琼脂培养基中、悬在液体培养基中、或利用喂养细胞培养等各种培养原生质体的方法。但是已经发现这些方法对于稻原生质体的培养无效，如果用上述常规方法之一进行稻原生质体的培养，原生质体不是死掉就是不能生长。
关于稻原生物体的培养技术，有报导提到，由缺乏硝酸还原酶的细胞得到的原生质体衍生出愈伤组织(Wakasa et al.，J.plant physiol.117pp.223-231，1984)。还有报导说，由花粉的愈伤组织得到的原生质体衍生出愈伤组织，从它产生出苗(Ohno et al.，Japanese Journal of Breeding 35pp.54-55，1985)。但是还未曾有从稻原生质体中再生出完全稻株的报导。
另一方面，很多研究者报导过，由稻的培养细胞再生出完全的植株(Nishi et al.，Nature 219pp.508-509，1968)。但是，这些方法没有利用原生质体。另外还发现，用这些方法由具有高度分化能力的细胞很难得到原生质体，而且原生质体难以培养。
于是，如果建立起一种能由原生质体再生出完全的水稻植株的方法，关于创造具有优异性能的水稻品种的研究就会前进一大步。
因此，本发明的目的是提供一种能够由原生质体再生出完整稻株(稻属作物，例如亚洲稻(Oryza Sativa)、非洲稻(Oryzaglaberrima)、多年生稻(Oryza perennis)等等)的方法。
在本发明的方法中，由水稻种子的胚、盾片或胚根中衍生出第一个愈伤组织，然后将其在液体培养基中培养，形成易于释放出原生质的细胞团。此细胞团用释放原生质的酶溶液处理以形成原生质体。将原生质体培养成第二个愈伤组织，在分化培养基中培养，再生出完整的植株。
利用本发明，第一次由原生质体再生出一个完整的稻株(属于稻属，例如亚洲稻、非洲稻、多年生稻等等)。
在本发明的方法中的第一步，由水稻种子的胚、盾片和胚根衍生出具有高度分化能力的愈伤组织，这可以用在琼脂培养基中培养得自稻种子的胚、盾片或胚根的细胞来实现。培养基可以是MS培养基(Murashige和Skoog，physiol.plant.15，pp.473-479，(1962))，B5培养基(Gamborg et al.，Exp.Cell Res.50，pp.151-158，(1968))，或N6培养基(Chu et al.Scientia Scinica 18pp.659-663)，R2培养基(Ohira et al.，plant Cell physiol.14，pp.1113-1121)。每种培养基含有(1)0.01-1%(重量)比的酵母抽提物，0.01-1%(重量)比的麦芽汁，0.01-1%(重量)比的酪蛋白水解物，或5-20%(重量)比的马铃薯抽提物，(2)0.1-10mg/l的2，4二氯苯氧基乙酸(以后称作2，4-D)，它是一种植物激素，和(3)0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素。培养温度可以从约20℃至约30℃，最好是26℃左右。可以采用继代培养的方式进行培养，由继代培养中得到愈伤组织。例如，可以每四周一次进行继代培养，直至得到愈伤组织。
这样得到的愈伤组织具有高度分化能力，但是难以从这些愈伤组织直接得到原生质体。于是在本发明中，先从愈伤组织得到小的细胞团，再由它们得到原生质。这些细胞团仍具有高的分化能力，但易于形成原生质体。
因此，本发明的第二步是由上述的第一步得到的愈伤组织形成一个细胞团，它仍保持着高度分化能力，但容易释放出原生质体。这一步可以通过在MS、N6或R2的液体培养基中培养愈伤组织来进行。每种培养基中含有(1)0.1-1%(重量)的酵母抽提物，0.1-1%(重量)的麦芽汁，0.1-1%(重量)的酪蛋白水解物，或5-20%(重量)的马铃薯抽提物，(2)0.1-10mg/l的2，4-D，和(3)0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素。培养基中细胞的群体密度最好是0.3到3%(重量)。培养温度可为约20至30℃，可以用继代培养的方式进行培养，由继代培养中得到细胞团。继代培养可以一周一次地进行。还可以采用转动培养的方式进行培养，此时液体培养基的容器在某一转速，例如70转/分下水平地旋转。通过这种培养，可以得到直径为1到3mm的、仍保持高度分化能力的细胞团。
本发明的第三步是从第二步得到的细胞团中得出原生质。这可以通过用形成原生质体的酶溶液处理细胞团来完成。举例来说，此溶液可以含有0.1-10、最好是1-5%(重量)的纤维素酶，0.1-5，最好是0.5-2%(重量)的浸解酶，0-5、最好是0.1-1%(重量)的氯化钙，以及0-5、最好是0.1-1%(重量)的葡聚糖硫酸酯的钾盐。此溶液还可以含有3-15%(重量)的甘露糖醇作为调节渗透作用的渗压剂。溶液的pH可为5.5，细胞团可在摇动下于酶溶液中在20-30℃孵化四至八小时。经过这样处理，细胞团可释放出大量的原生质体。将含有原生质体的酶溶液过滤以除去未消化的细胞团，在例如50克下离心滤液，收集原生质体。
本发明的第四步是培养这样得到的原生质体以产生愈伤组织。已经知道当愈伤组织连续地继代培养时其分化能力急剧下降。如果愈伤组织的分化能力低，则不能由它得到完全的植株，因此，在这一步维持所要培养的细胞的高分化能力很重要。根据本发明，这可以用在N6、B5或R2培养基的条件培养基中培养原生质体来实现，每一种培养基中含有(1)0.1-1%(重量)的酵母抽提物，0.1-1%(重量)的麦芽汁，0.1-1%(重量的酪蛋白水解物，或5-20%(重量)的马铃薯抽提物，(2)0.1-10mg/l的2，4-D，和(3)0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素。在上述第二步中使用的培养基的滤液可以方便地用作条件培养基。这时可以在滤液中补充新鲜的培养基。另外，本发明人曾发现，不用常规的渗压剂、例如甘露糖醇或它与蔗糖的混合物，而用蔗糖来调节培养基的渗透作用，可以促进原生质的分裂。于是，条件培养基中可以含有例如0.4M的蔗糖。培养基的pH最好是用盐酸调到5.2或更低。条件培养基中最好补加2，4-D以促进原生质体的增殖能力。另外，培养基的容器最好涂上亲水支持体，例如半固态的琼脂、藻酸、明胶等等，支持体中含有渗压剂，培养基置于亲水支持体层之上，其厚度为100-400微米、最好是200-300微米。与将介质放在未涂琼脂的容器中的情形相比，这样作的结果使细胞更多地与空气或氧接触。这是因为，若无琼脂涂层，培养基由于自身的表面张力而形成球形水滴，故每单位体积的介质与空气的接触面积减小;而当培养基置于琼脂层上时，琼脂层降低了培养基的表面张力，从而得到了200-300微米厚的培养基层，它具有较大的空气接触面积。本发明人发现，培养的需养条件对原生质生长很重要。琼脂层的厚度应为1毫米或更小。最好是200微米或更薄。随着培养的进行，培养基可能被补加的含有较低浓度渗压剂(例如蔗糖)的新鲜培养基所稀释。培养可以在大约20°-30℃的温度下进行，最好是27℃左右，直到得到愈伤组织。原生质体的群体密度应为104-107原生质体/毫升，最好是105-5×106原生质体/毫升。
在本发明的第五步，通过在分化培养基中培养第四步中得到的愈伤组织的方法，再生出完全的水稻植株。这一步用的分化培养基可以是MS培养基，它含有(1)0.1-1%(重量)的酵母抽提物，0.1-1%(重量)的麦芽汁，0.1-1%(重量)的酪蛋白水解物，或5-20%(重量)的马铃薯抽提物，和(2)0-10mg/l的苄基腺嘌呤或0-10mg/l的激动素，培养温度可为约20至30℃。在分化培养基中培养愈伤组织之前，最好先在生长培养基中培养。生长培养基可以是R2、N6或MS培养基，每一种里含有(1)0.1-1%(重量)的酵母抽提物，0.1-1%(重量)的麦芽汁，0.1-1%(重量)的酪蛋白水解物，或5-20%(重量)的马铃薯抽提物，(2)0.1-10mg/l的2，4-D，以及(3)0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素。培养温度可为约20至约30℃。
通过下列例证将更易了解本发明。应该注意，下列例证仅作为说明用，本发明的应用范围决不限于此。
例1-Ⅰ 具有高度分化能力的愈伤组织的诱导及其继代培养稻种(亚洲稻Oryza sativa栽培品系，品种Nihonb-are)在70%的乙醇水溶液中浸渍1分钟，而后在次氯酸钠水溶液(氯含量5%(重量)中浸15分钟。用己灭菌的水洗种子三次，将种子种在N6琼脂培养基上，培养基中含有0.3%(重量)的酪蛋白水解物，2ppm的2，4-D和1ppm的苄基腺嘌呤。在26℃培养三周之后，由种子的盾片形成了愈伤组织。将这些愈伤组织在同样的条件下每四周继代培养一次。
例1-Ⅱ 具有高度分化能力的愈伤组织的诱导及继代培养将未成熟的稻种(亚洲稻Oryza Sativa栽培品系，品种Sa-sanishiki)在70%乙醇水溶液中浸泡1分钟以消毒其外表面，然后用已灭菌的水洗。由具外果壳的种子中取出未成熟的胚，将其种在含有0.3%(重量)酵母抽提物和2ppm2，4-D的MS琼脂培养基上。在26℃培养三周后生成愈伤组织。这些愈伤组织在同样条件下每四周一次进行继代培养。
例1-Ⅲ 具有高度分化能力的愈伤组织的诱导与继代培养将灭过菌的稻(Oryza sativa栽培品系，品种koshihik-ari)种在由琼脂构成的培养基上，一周后，将长出的胚芽割下种在含有2ppm2，4-D的B5培养基上。在26℃下培养三周后生成了愈伤组织。这些愈伤组织在同样条件下每四周一次进行继代培养。
例2 衍生出的愈伤组织在液体培养基中的培养将由例1-Ⅰ、1-Ⅱ、和1-Ⅲ中继代培养得到的愈伤组织转移到表1所列的液体培养基中进行继代培养。取30ml的各种液体培养基置于100ml瓶中，细胞在这些培养基中培养，其间在26℃下以70转/分的速度转动该瓶。每周进行一次继代培养。培养基中的细胞含量在培养开始时约为0.3%(重量)，在结束时约为3%(重量)。
表1 液体培养基的成分
CH酪蛋白水解物YE酵母抽提物PE马铃薯抽提物BA苄基腺嘌呤例3 原生质体的分离在继代培养后培养了七天的细胞用作为这一步的起始物。释放原生质的酶溶液中含有4.0%(重量)的纤维素酶(Cellulase)Onozuka RS(Yakult药厂有商品供应)，1.0%(重量)的浸解酶(Macerozyme)R-10(Yakult药厂有商品供应)，0.5%(重量)的氯化钙，0.5%(重量)的葡聚糖硫酸酯钾盐，以及0.4M的甘露糖醇。在27℃下轻轻摇荡含有细胞的溶液6小时以得到原生质体。然后将含原生质体的酶溶液过滤，以除去未消化的细胞团。滤液在50g下离心5分钟使原生质体沉淀。沉下来的原生质体用0.4M的葡萄糖水溶液洗三次，在下一步培养。
例4 原生质体培养基的配方(条件培养基)将上述例2中的培养基离心以除去细胞，在10ml培养物滤液中加入50μl100ppm的2，4-D溶液和0.4M蔗糖，溶液的pH用0.1N的盐酸调至4.5。在此培养基中，按其体积的1/4加入同样的但是新鲜的基础培养基(例如，在例2中若用R2培养基，则是R2培养基)，其中含有0.4M的蔗糖。
例5 原生质体的培养将200μl上述配方的条件培养基放在直径35mm的塑料的陪替氏(petri dish)培养皿中，培养皿底面上涂有一薄层琼脂。再加入30μl含有106原生质/ml的原生质体悬浮液，使混合物均匀铺展。在培养皿封口之后，在27℃下于暗处进行培养。
大约一周之后，观察到第一次分裂，大约一个月后形成了直径约100μm的小细胞团(见表2)。这时往培养物中加入200μl的同样的新鲜基础培养基，但它含的蔗糖较少，为3%(重量)。再过两周，重复同样的操作。在原生质起始培养的两个月之后，形成了直径1mm的小的愈伤组织。
表2 在培养一周之后，每个陪替氏培养皿中小细胞团的数目
例6 愈伤组织的生长将由原生质体衍生出的愈伤组织转移到愈伤组织生长培养基中，使愈伤组织在26℃下生长约二周。生长培养基(琼脂)的成分及愈伤组织的生长速度如表3所示。
表3 生长培养基的成分与生长速度
＊+++很高 ++高 +中等 ±几乎不生长例7 完整植株的再生长在生长培养基上的愈伤组织于26℃下在表4所列的分化培养基(琼脂)上分化成完整的植株。在移栽一周以后，形成了禄色斑点，移栽一个月以后再生出小的完整植株。将它移栽到盛在大试管里的琼脂上，得到了中等大小的完整植株。
表4 分化培养基的成分与完整植株的再生
＊GM生长培养基(栏中的编号与表3中培养基编号相同)＊＊再分化成完整植株
权利要求
1.一种形成水稻植株的方法，特征在于按叙述次序，其步骤为由水稻种子的胚、盾片或胚根衍生出第一个愈伤组织；在液体培养基中将第一个愈伤组织培养成易释放出原生质体的细胞团；用释放原生质体的酶溶液处理细胞团以释放出原生质体；将原生质体培养成第二个愈伤组织；由第二个愈伤组织再生出水稻植株。
2.按权利要求
1中的方法，其中第一步是在MS、B5、N6或R2琼脂培养基中培养胚、盾片或胚根，每种培养基中含有(1)0.01-1%(重量)的酵母抽提物，0.01-1%(重量)的麦芽汁，0.01-1%(重量)的酪蛋白水解物，或5-20%(重量)的马铃薯抽提物，(2)0.1-10mg/l的2，4-D，和(3)0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素。
3.按权利要求
2中的方法，以继代培养方式培养胚、盾片、胚根的方法。
4.按权利要求
1中的方法，其中第二步是将第一个愈伤组织在R2、N6或MS培养基中培养，每种培养基中含有(1)0.1-1%(重量)的酵母抽提物，0.1-1%(重量)的麦芽汁，0.1-1%(重量)的酪蛋白水解物，或5-20%(重量)的马铃薯抽提物，(2)0.1-10mg/l的2，4-D，和(3)0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素，培养基中的细胞浓度为0.3-3%(重量)。
5.按权利要求
4中，以继代培养的方式培养第一个愈伤组织的方法。
6.按权利要求
1中的方法，其中释放原生质体的酶溶液为一水溶液，它含有0.1-10%(重量)的纤维素酶，0.1-5%(重量)的浸解酶，0-5%(重量)的氯化钙，0-5%(重量)的葡聚糖硫酸酯的钾盐，和3-15%(重量)的甘露糖醇。
7.按权利要求
1中的方法，其中第四步是在条件培养基中培养原生质体，此条件培养基由第二步所用的培养基得到，并且放在含有渗压剂的亲水支持体层上，亲水支持体层上条件培养基的厚度为200-300μm。
8.按权利要求
7的方法，其中条件培养基的渗透作用用蔗糖调节，pH不大于5.2。
9.按权利要求
7中，亲水支持体采用琼脂、藻酸或明胶的方法。
10.按权利要求
1的方法，其中的第五步是将第二个愈伤组织在分化培养基中培养，该培养基为MS培养基，含有(1)0.1-1%(重量)的酵母抽提物，0.1-1%(重量)的麦芽汁，0.1-1%(重量)的酪蛋白水解物或5-20%(重量)的马铃薯抽提物，(2)0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素。
11.按权利要求
1中的稻为Oryza sativa的方法。
12.按权利要求
10中的方法，其中的第五步又包括，在第二个愈伤组织于分化培养基中培养之前，先将它放在MS、B5、N6或R2培养基中生长，上述各培养基含有(1)0.1-1%(重量)的酵母抽提物，0.1-1%(重量)的麦芽汁，0.1-1%(重量)的酪蛋白水解物，或5-20%(重量)的马铃薯抽提物，(2)0.1-10mg/l的2，4-D，和(3)0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素。
13.一种形成稻株的方法，按叙述次序，其步骤为将水稻种子的胚、盾片或胚根在MS、B5、N6或R2琼脂培养基中培养，以形成第一个愈伤组织，各培养基中含有(1)0.01-1%(重量)的酵母抽提物，0.01-1%(重量)的麦芽汁，0.01-1%(重量)的酪蛋白水解物，或5-20%(重量)的马铃薯抽提物，(2)0.1-10mg/l的2，4-D，和(3)0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素;在R2、N6或MS液体培养基中培养第一个愈伤组织，以形成易释放出原生质体的细胞团，每种培养基中含有(1)0.1-1%(重量)的酵母抽提物，0.1-1%(重量)的麦芽汁，0.1-1%(重量)的酪蛋白水解物，或5-20%(重量)的马铃薯抽提物，(2)0.1-10mg/l的2，4-D，和(3)0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素，培养基中的细胞浓度为0.3-3%(重量);用原生质体释放酶的水溶液处理细胞团以放出稻原生质体，酶溶液中含有0.1-10%(重量)的纤维素酶，0.1到5%(重量)的浸解酶，0到5%(重量)的氯化钙，0到5%(重量的葡聚糖硫酸酯钾盐，以及3到15%(重量)的甘露糖醇;在条件培养基中培养原生质体以形成第二个愈伤组织，条件培养基得自第二步所用的培养基，并放在亲水的支持体层上，放在琼脂层上的条件培养基的厚度为200至300μm;在分化培养基中将第二个愈伤组织培养成水稻植株，分化培养基为MS培养基，含有(1)0.1-1%(重量)的酵母抽提物，0.1-1%(重量)的麦芽汁，0.1-1%(重量)的酪蛋白水解物，或5-20%(重量)的马铃薯抽提物，(2)0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素。
14.权利要求
13中稻为Oryza sativa的方法。
专利摘要
由原生质体生成完全的水稻植株的方法。为得到此原生质体，由稻种的胚、盾片或胚根衍生出愈伤组织，在液体培养基中培养愈伤组织以形成易放出原生质体的细胞团。用原生质体释放酶溶液处理细胞团以得到原生质体。然后将原生质体培养成愈伤组织，再在分化培养基中培养此愈伤组织，再生出整株稻。
文档编号C12N15/02GK86103448SQ86103448
公开日1987年1月21日 申请日期1986年5月21日
发明者藤村达人, 樱井基, 赤木宏守, 根岸友子, 広濑晃 申请人:三井东庄化学株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan