专利名称:一种鲤春病毒血症病毒rt-lamp检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于鱼类病毒检测技术领域：
，具体涉及一种鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒，还涉及一种利用鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法。
背景技术：
趣春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus, SVCV),属单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales),弹状病毒科(Rhabdoviridae),水泡性口炎病毒属(Vesiculovirus)的暂定种，目前仅有一个血清型。SVCV引起的鲤春病毒血症(SpringViraemia of Carp, SVC)是一种急性、出血性并有高度传染的流行病，严重危害渔业生产并能造成毁灭性打击。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必报的重要疫病。2008年我国新颁布的动物疫病名录中将其列为一类动物疫病，是新中国成立以来第一个也是唯一一个鱼类 病毒疫病被列为一类传染病。
SVC对水产养殖特别是鲤科鱼类养殖的危害巨大。由于暂时没有较好的防治药物和方法，对该病的防控需要依赖实验室的诊断，因此建立快速准确的检测方法至关重要。SVCV检测的“金标准”是通过细胞培养分离病毒，利用免疫学技术或分子生物学技术进行鉴定，这个过程耗时长，程序复杂。另外制备高效价抗血清困难，也限制了免疫学方法的使用。OIE水生动物疾病诊断手册、我国关于SVCV检测的国标和行标，已经将RT-PCR列为诊断方法，但是RT-PCR方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适用于现场快速检测及基层普及应用。
环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技术是Notomi等于2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法(国际专利公开号WO 00/28082)，针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，适合于现场和实验条件较简单的实验室进行快捷检测。逆转录环介导恒温扩增(RT-LAMP)是在反应液中加入一定量的逆转录酶，实现RNA的一步扩增。引入一对环状引物的改进方法，进一步缩短反应时间。
发明内容
本发明的一个目的是在于提供了一种鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒，根据GenBank公布的SVCV毒株的N基因片段编码区序列(U18101),应用PrimerExplorer V4(http://primerexplorer. jp/elamp4. O. 0/index, html)在线软件设计特异性引物，利用RT-LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平对鲤春病毒血症病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。
本发明的另一个目的是在于提供了一种利用鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法，本方法仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的SVCV，能检测SVCV感染的病鱼组织，能检测SVCV感染的细胞(例如EPC细胞)，非常适用于SVCV的现场快速检测。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案
一种鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒,包括以下成分
该试剂盒包括以下成分10XThermoPolReaction Buffer ；Bst DNA 聚合酶(NEB) ；dNTPs ;AMV 逆转录酶(BBI);外引物 F3 和 B3、内引物 FIP 和 BIP,Betaine (Sigma),MgCl2, DTT (Invitrogen),1000XSYBR Green I (Invitrogen)。
F3 5, -GGGATAGCTTCGGACACAAG-3,；
B3 5, -CCATCAGCAAAGTCCGGTAT-3，；
FIP 5, -GTTTCCCATCTGGTAGCCCGTCTTTTAGATCGGGCCTTTTAACCTG-3,；
BIP 5, -AGGTGAGTGCTGAGGATGATGCTTTTTTGCCCTTCCCACTCTGT-3,。
一种利用鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法，其步骤是
I、病毒RNA的获取
采用TRIzof3或TRIzoM) LS试剂或柱吸附洗脱法等提取样本总RNA。
2、RT-LAMP 扩增
采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8μΜ，外引物F3和Β3各O. I μ M，dNTPs ImM, Betaine O. 5M, DTT 4mM, MgCl2 2-10mM, Bst DNA 聚合酶 8U，AMV 逆转录酶 5U，模板 RNA5 μ 1，IOXThermoPol Reaction Buffer 2· 5 μ I。选择 55_65°C的温度范围和30 — 120分钟的时间范围进行RT-LAMP反应之后，80°C灭活2分钟。
3、检测结果判定，可用下述三种方法之一进行结果的判定
I)发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
2)每 25 μ I 体系的反应管加 1000XSYBR Green I (Invitrogen) 1-2 μ I, l-5min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性。
3)取扩增产物，用2% (w/v)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
一种利用鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法(最佳条件)，其步骤是
I、病毒RNA的获取
采用TRIzd 或TRIzol LS试剂或柱吸附洗脱法等提取样本总RNA,模板RNA在950C 5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度。
2、RT-LAMP 扩增
采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8μΜ，外引物F3和Β3各O. I μ M，dNTPs ImM, Betaine O. 5M, DTT 4mM, MgCl2 8mM, Bst DNA 聚合酶 8U，AMV 逆转录酶5U，模板 RNA 5 μ I, IOXThermoPol Reaction Buffer 2.5 μ I。反应管于 64°C温育 60 分钟进行RT-LAMP反应之后，80°C灭活2分钟。
3、检测结果判定，可用下述三种方法之一进行结果的判定
I)发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
2)每 25 μ I 体系的反应管加 1000XSYBR Green I (Invitrogen) 1-2 μ l，l_5min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性。
3)取扩增产物，用2% (w/v,以下相同)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
与现有技术相比，本发明具有以下优点
I、本发明公开了一种鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒；
2、特异性好，能有效检测出SVCV病毒；3、快速高效，检测时间约I小时，非常适用于SVCV的现场快速检测；
4、不需要特殊试剂与设备，检测成本低；
5、鉴定简单，通过从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，经肉眼就可判断结果，通过加入1000XSYBR Green I,可提高结果的灵敏度。
图I为一种鲤春病毒血症病毒RT-LAMP试剂盒检测结果的特异性的示意图。
从左至右的泳道依次为水的空白对照、正常EPC细胞总RNA、CRV感染CCO细胞的总 RNA、GCRV-104 株感染 CIK 细胞的总 RNA、SVCV 感染 EPC 细胞的总 RNA、DL2, OOOMarker。
具体实施方式
下列实例进一步说明本发明，但不应该当做对本发明的限制。若无特别说明，本发明所用试剂均为上海生工生物工程公司生产。
实施例I :
一种鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒,包括以下成分
该试剂盒它包括以下成分10XThermoPol Reaction Buffer ；Bst DNA聚合酶(NEB) ；dNTPs ;AMV 逆转录酶(BBI);外引物 F3 和 B3、内引物 FIP 和 BIP,Betaine (Sigma),MgCl2, DTT (Invitrogen),1000XSYBR Green I (Invitrogen)。
F3 5, -GGGATAGCTTCGGACACAAG-3,
B3 5, -CCATCAGCAAAGTCCGGTAT-3,
FIP 5, -GTTTCCCATCTGGTAGCCCGTCTTTTAGATCGGGCCTTTTAACCTG-3,
BIP 5, -AGGTGAGTGCTGAGGATGATGCTTTTTTGCCCTTCCCACTCTGT-3,。
实施例2
鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒不同浓度的Mg2+的优化
一、取待检样品提取病毒RNA:
培养鲤上皮乳头瘤细胞(EPC细胞)至汇合单层，吸出培养液，以感染复数为O. I的剂量，接种ImL经4000r/min离心5min除去细胞碎片的鲤春病毒血症病毒(张朋，刘荭，陈孝煊，等.鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定[J]，中国预防兽医学报，2011,33(4):305-308.)细胞毒材料，添加 10 μ L 的 Polybrene(终浓度 10 μ g/ml )，置于 26°C培养箱中吸附lh，使病毒吸附细胞，吸附过程中每20min轻轻晃动培养瓶一次，使病毒液与细胞单层充分均匀接触，吸附Ih后，吸弃病毒液，加入5mL 2%胎牛血清(V/V)的培养液，置26 V培养，直至细胞出现明显的致细胞病变效应，收集细胞病变材料，于-80°C至室温(20-25°C )反复冻融 3 次，5000r/min 离心 30min,取上清 250 μ 1，用TRlzoi8 LS( Invitrogen)试剂按照说明书提取RNA，最后溶于50 μ I灭菌水，_80°C保存备用。
二、RT-LAMP扩增的反应体系
采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8μΜ，外引物F3和Β3各O. I μ M，dNTPs ImM, Be taine O. 5M, DTT 4mM, MgCl2, Bst DNA 聚合酶 8U，AMV 逆转录酶 5U，模板 RNA5 μ I, IOXThermoPol Reaction Buffer 2·5μ1。
其中Mg2+的浓度分别为2、4、6、8和10mM。
三、RT-LAMP扩增的反应条件
反应管于64°C温育60分钟后，80°C灭活2分钟。
四、检测结果判定
取8 μ I扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示Mg2+的浓度为8mM时结果最好。
实施例3
鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测方法反应温度的优化
—、取待检样品提取病毒RNA:
待SVCV感染的EPC细胞出现90%病变后收获(制备方法同实施例2)，于_80°C至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min,取上清250 μ 1，用TRlzd LS试剂按照说明书提取RNA，最后溶于50 μ I灭菌水，_80°C保存备用。
二、RT-LAMP扩增的反应体系
采用25 μ I反应体系，包括:内引物FIP和BIP各O. 8μΜ，外引物F3和Β30. I μ Μ，dNTPs ImM, Betaine O. 5M, DTT 4mM, MgCl2 8mM, Bst DNA 聚合酶 8U，AMV 逆转录酶 5U，模板RNA 5 μ 1,10XThermoPol Reaction Buffer 2.5 μ I。
三、RT-LAMP扩增的反应条件
反应管分别置于60、61、62、63、64、65°C温育60分钟后，80°C灭活2分钟。
四、检测结果判定
取8 μ I扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示64°C时结果最好。
实施例4
鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测方法的特异性
一、取待检样品提取病毒RNA:
SVCV (张朋，刘荭，陈孝煊，等.鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定[J]，中国预防兽医学报，2011，33 (4) :305-308.)感染的EPC细胞、CRV (曾令兵、徐进、李艳秋，等.斑点叉尾鮰出血病病原呼肠孤病毒的分尚与鉴定[J]，病毒学报，2009, 25
(6)=460-466.)感染的 CCO 细胞、GCRV-104 株(CCTCC N0:V201217)感染的 CIK 细胞出现90%病变后收获(上述病毒的制备方法同SVCV)，于-80°C至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250μ 1，用TRfed LS试剂按照说明书提取RNA，最后溶于50 μ I灭菌水，-80°C保存备用。
二、RT-LAMP扩增的反应体系[0074]采用25 μ I反应体系，包括:内引物FIP和BIP各O. 8μΜ，外引物F3和Β30. I μ Μ，dNTPs ImM, Betaine O. 5M,DTT 4mM,MgCl28mM,Bst DNA 聚合酶 8U，AMV 逆转录酶 5U，模板 RNA
5μ 1,10XThermoPol Reaction Buffer 2.5 μ I。
三、RT-LAMP扩增的反应条件
反应管于64°C温育60分钟后，80°C灭活2分钟。
四、检测结果判定
取8 μ I扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图 片显示针对SVCV设计的特异RT-LAMP引物组能保证对SVCV的特异性检测，只检测出SVCV，而GCRV-104、CRV和对照均无法检出(图I)。
权利要求
1.一种鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分 该试剂盒包括以下成分10 X ThermoPol Reaction缓冲液;ifei DNA聚合酶；dNTPs ;AMV逆转录酶；外引物 F3 和 B3、内引物 FIP 和 BIP、Betaine，MgCl2，DTT, 1000X SYBR GreenI；
F3 :5’_ GGGATAGCTTCGGACACAAGB3 :5’_ CCATCAGCAAAGTCCGGTAT -3’ ；
FIP :5’_ GTTTCCCATCTGGTAGCCCGTCTTTTAGATCGGGCCTTTTAACCTGBIP :5’_ AGGTGAGTGCTGAGGATGATGCTTTTTTGCCCTTCCCACTCTGT- 3’。
2.利用权利要求
I所述的一种鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法，其步骤是 1)、病毒RNA的获取 采用TRIzof或TRIzofLS试剂或柱吸附洗脱法提取样本总RNA ； 2)、RT-LAMP扩增 采用25μ I反应体系内引物FIP和BIP各O. 8 μ Μ，外引物F3和Β3各O. I μ Μ，dNTPsImM, BetaineO. 5M, DTT4mM, MgCl2 2-10mM, Bst DNA 聚合酶 8U, AMV 逆转录酶 5U，模板 RNA5y 1，IOXThermoPol Reaction Buffer 2. 5 μ 1，选择 55-65°C 和 30-120 分钟进行RT-LAMP反应之后，80°C灭活2分钟； 3)、检测结果判定，采用下述三种方式之一 A、发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性； B、每25μ I体系的反应管加1000X SYBR Green I 1-2 μ 1,1-5 min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性； C、取扩增产物，用2%w/v的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
3.根据权利要求
2所述的一种鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法，，其特征在于=MgCl2的浓度为8mM。
4.根据权利要求
2所述的一种鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法，，其特征在于:反应温度为64V。
5.根据权利要求
2所述的一种鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法，，其特征在于模板RNA在95°C 5分钟后置于冰浴中进行预处理。
专利摘要
本发明公开了一种鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法，一种鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒,包括以下成分10×ThermoPolReaction缓冲液；BstDNA聚合酶；dNTPs；AMV逆转录酶；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine，MgCl2，DTT,1000×SYBRGreenI。本发明具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点，仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的SVCV，能检测SVCV感染的病鱼组织，能检测SVCV感染的细胞，非常适用于SVCV的现场快速检测。
文档编号C12Q1/68GKCN102876811SQ201210403053
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月19日
发明者张辉, 曾令兵, 周勇, 范玉顶, 徐进 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan