专利名称:链格孢α-L-鼠李糖苷酶基因及其应用的利记博彩app
链格孢α-L-鼠李糖苷酶基因及其应用
发明领域
本发明涉及一种α -L-鼠李糖苷酶基因，尤其涉及一种来源于链格孢的α _L_鼠李糖苷酶基因及其应用，属于基因工程技术领域：
。
技术背景
α -L-鼠李糖苷酶(α -L-rhamnosidase，EC 3. 2. 1. 40)广泛存在于动物、植物和微生物中，能够水解多糖和其他糖苷中的α-L-鼠李糖苷键，在食品、医药及化工领域有重要的应用价值。α -L-鼠李糖苷酶能够水解柑橘类果汁中主要的苦味物质柚苷，大大降低苦味，改进果汁口感；还能够水解葡萄酒中大量的键合态芳香物质，释放出糖苷配基，产生游离的芳香物质，使葡萄酒增香并提高风味。此外，α-L-鼠李糖苷酶在化合物的结构鉴定、 改进抗癌药物的活性方面也有广泛应用。
公开号为CN101914451A(申请号为201010220786. X)的中国专利，公开了一种产生α-L-鼠李糖苷酶的链格孢Ll (Alternaria sp. Li)菌株、特征、培养方法及其应用于水解柚苷的方法。该菌株已于2010年3月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 3688。链格孢(Alternaria sp.)Ll菌株培养简单，遗传性质稳定，水解效率高，酶活稳定，具有很强的工业化生产优势和广阔的应用前景，可应用于食品工业中柑橘类果汁的酶法脱苦等领域。
目前，α -L-鼠李糖苷酶相关研究大多局限于原始酶的纯化和性质研究，其基因克隆尤其是真菌来源酶基因克隆研究很少，仅有3例真菌α -L-鼠李糖苷酶基因报道。 α -L-鼠李糖苷酶性质研究主要涉及水解功能，其应用于糖苷合成方面的研究报道较少。因此，获得新的真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶基因并扩展其在糖苷合成方面的应用具有重要
眉、ο
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种来源于链格孢的α -L-鼠李糖苷酶基因及其应用。
一种α -L-鼠李糖苷酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。该基因来源于菌种保藏号为CGMCC No. 3688的链格孢Ll (Alternaria sp. Li)，其全长2046碱基。
一种由上述α -L-鼠李糖苷酶基因编码的α -L-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。该序列全长681个氨基酸。
一种插入了上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的表达载体。
上述表达载体为pPIC9K表达载体。
一种插入了包含上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No. 1序列表达载体的重组细胞。
上述重组细胞为毕氏酵母GS115。
所述α -L-鼠李糖苷酶在食品、制药领域方面的应用。
3[0013]上述应用，步骤如下
将(1-1^-鼠李糖苷酶基因克隆到？？扣91(表达载体上，转化毕氏酵母65115( 化11化 pastoris GS115)，甲醇诱导高效表达重组α-L-鼠李糖苷酶，应用该酶水解柑橘类果汁中主要的苦味物质柚苷，或以鼠李糖为供体，甲醇、乙醇、异丙醇、葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、七叶苷为受体进行转糖基反应。
上述α-L-鼠李糖苷酶基因在毕氏酵母中表达的重组酶为二亚基糖蛋白，聚合体分子量为240士 IOkDa,单亚基分子量为120士5kDa，用糖酰胺酶-F (PNGase F)处理去除糖链修饰后单亚基分子量为70士5kDa ；酶对对硝基苯- α -L-鼠李糖苷(p-nitrophenyl-α -L-rhamnopyranoside, pNPR)适宜反应的温度为60_65°C，适宜反应的pH为5. 5-7. 5 ；在 250C _60°C范围内保温池，能够保留80%以上的活性；在pH3. 5-9. 0的范围内4°C保存1 可以保留75%以上的活性；酶对对硝基苯-α -L-鼠李糖苷的Km值为1. 27mmol/L。
上述α -L-鼠李糖苷酶基因在毕氏酵母中表达的重组酶能够水解柑橘类果汁中主要的苦味物质柚苷，降低果汁苦味。
上述重组酶对pNPR的最适反应温度为65°C JfpNPR的最适反应pH为6. 5 7. 0。
以上操作步骤、实验条件及试剂如无特别说明，均采用本领域常规操作和常用试剂。
本发明有益效果如下
本发明所述α-L-鼠李糖苷酶基因克隆到PPIC9K表达载体上，转化毕氏酵母 GS115，甲醇诱导表达，发酵液产酶量426mg/L。该α -L-鼠李糖苷酶基因在毕氏酵母中表达的重组酶能够高效水解柑橘类果汁中的主要苦味物质柚苷，并且能够以鼠李糖为供体、多种物质为受体合成转糖基产物，在食品、制药和化工行业有重要的潜在应用价值。本发明提供了新的α -L-鼠李糖苷基因来源，并通过高效重组表达提供了大量的α -L-鼠李糖苷酶。
图1是本发明所述的链格孢Ll重组α -L-鼠李糖苷酶的SDS-PAGE电泳图；
其中，1、链格孢Ll重组α -L-鼠李糖苷酶，2、糖酰胺酶_F(PNGase F)处理后的链格孢Ll重组α-L-鼠李糖苷酶，3、蛋白分子量标准；
图2是本发明所述链格孢Ll重组α -L-鼠李糖苷酶水解柚苷的HPLC检测图；
其中，a、链格孢Ll重组α -L-鼠李糖苷酶处理完柚苷后的HPLC检测图，峰1为柚苷，峰2为水解产物，b、对照组。
图3是本发明所述链格孢Ll重组α -L-鼠李糖苷酶以鼠李糖为供体、葡萄糖为受体合成糖基产物的HPLC检测图；
其中，a、反应后产物的HPLC检测图，峰1为鼠李糖，峰2为葡萄糖，峰3-4为合成的转糖基产物，b、对照组。
具体实施方式
下面结合
和实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。实施例中未明确限定的均可按本领域现有技术。
实施例1 链格孢Ll (Alternaria sp. Li)总RNA的提取[0029]将链格孢Ll (Alternaria sp. Li)，菌种保藏号为CGMCC No. 3688的菌种接种于 150ml产酶发酵培养液，28°C培养32h，用DEPC处理过的超纯水洗涤菌体三次，滤纸过滤收集菌体，液氮研磨破壁。取IOOmg菌体，加入Iml Takara RNAiso Plus，混勻，于15 30°C 静置5min，然后加入200 μ L氯仿，震荡15s，在室温静置5min，12000转/分、4°C离心30min， 将上清转移到新管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混勻后，15 30°C静置10min，2000转 /分，4°C离心lOmin，去除上清；加入75%乙醇ImL洗涤沉淀，7500转/分、4°C离心5min去除乙醇，晾干5min ；沉淀溶于一定量的DEPC处理过的灭菌超纯水中备用。
上述产酶发酵培养液成分玉米浆30mL/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾5g/L，柚苷 5g/L，pH自然，115°C灭菌30分钟。
实施例2 链格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶基因部分cDNA序列的PCR扩增
从GenBank中检索到不同菌株α -L-鼠李糖苷酶基因的cDNA序列，设计一对兼并 PCR 引物(N-TERiPGl-R)
oligo-dT 5' _xxxxxxxxxxxxxxxxxx_3‘ SEQ ID NO. 6
N-TER 5' -ACCCCHTACTCNCARTACATCYTCGC-3‘ SEQ ID NO. 7
Gl-R 5' -GGRCCNGYRGACCANCCRTG-3‘ SEQ ID N0. 8
以提取的链格孢总RNA为模板，采用上述oligo-dT引物进行反转录合成cDNA第一条链，其反应总体积为20 μ L，先混合引物(10 μ mol/L) 1 μ L、模板RNA3 μ g与无RNA酶的超纯水共12 μ L，65°C预变性5分钟，置于冰上；然后加入5 X cDNA合成缓冲液4 μ L、RNA酶抑制剂(20U/μ L) 1 μ LUOmM dNTP 2 μ L、反转录酶(200U/μ L) 1 μ L，混勻，42°C 延伸 60 分钟，70°C终止反应5分钟。以上述反应合成的cDNA第一条链为模板，用N-TER和Gl-R引物进行 PCR 扩增，其总体积为 50 μ L,即超纯水；35 μ L, 10XPCR buffer 5 μ L、dNTP2. 4mmol/L、 引物各 1 μ mol/L、MgCl2L 5mmol/L、模板 cDNAlOOng、TaKaRa Taq 酶 2. 5U 共 15 μ L。PCR 扩增条件95°C预变性5分钟，反应30个循环(95°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸1分钟)，30个循环结束后72°C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪检测，然后回收，测序大小为1619bp。所得产物即为链格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶基因部分cDNA序列，测得序列如SEQ ID No. 3。
实施例3 链格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶基因cDNA 3 ‘端序列的扩增
根据SEQ ID No. 3的序列，除N-TER外，再设计一条嵌套PCR正义引物(F2)， 3' RACE法合成α-L-鼠李糖苷酶基因cDNA的3'端片段。引物序列如下
3' AP 5' -GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' SEQ ID N0.9
第一轮PCR引物
N-TER 5' -ACCCCHTACTCNCARTACATCYTCGC-3‘ SEQ ID NO. 10
3' AUAP 5' -GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3‘ SEQIDN0.11
第二轮PCR引物
F2 5' -CTGGCTTCGCTTCGGTATGGG-3‘ SEQ ID N0. 12
3' AUAP 5' -GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3‘ SEQ ID N0. 13
以提取的链格孢总RNA为模板，采用上述3' AP引物进行反转录合成cDNA第一条链。以cDNA第一条链为模板，用N-TER和3' AUAP引物进行第一轮PCR扩增，再以上述 PCR产物为模板，用F2和3 ‘ AUAP引物进行第二轮PCR扩增验证。PCR扩增条件和PCR产物回收方法同实施例2。PCR产物测序大小为2065bp。所得产物即为链格孢Ll α-L-鼠李糖苷酶基因cDNA3'端序列，测得序列如SEQ ID No. 4
实施例4 链格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶基因cDNA 5 ‘端序列的扩增
根据SEQ ID No. 4的序列，设计两条嵌套PCR反义引物(Rl和R2)，5 ‘ RACE法合成α-L-鼠李糖苷酶基因cDNA的5'端片段。引物序列如下
Rl 5' -CAATGAGGACTCGGAGAAGGTG-3‘ SEQ ID NO. 14
第一轮PCR引物
5' AP 5' -GGCCACGCGTCGACTAGTACCCCCCCCCCCCCCCCC-3' SEQ ID NO. 15
Rl 5' -CAATGAGGACTCGGAGAAGGTG-3‘ SEQ ID NO. 16
第二轮PCR引物
5' AUAP 5' -GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3‘ SEQ ID NO. 17
R2 5' -TGTTGCTACTTCGCCTGTGAAAA-3‘ SEQ ID NO. 18
以提取的链格孢总RNA为模板，采用上述Rl引物进行反转录合成cDNA第一条链。 将上述反转录产物于37°C加Nase H反应1小时，PCR产物回收试剂盒回收。末端脱氧核糖核酸转移酶(TaKaRa)在回收产物5'端加上polyG寡核苷酸序列，反应条件是37°C保温30分钟，加等体积酚/氯仿(24 1)，混勻，12000转/分离心20分钟，取上清，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的醋酸钠(3mol/L)沉淀DNA，离心收集沉淀，加适量体积的无 RNA酶的灭菌超纯水溶解。以上述加polyG的cDNA第一条链为模板，用5' AP和Rl引物进行第一轮PCR扩增，再以该PCR产物为模板，用5' AUAP和R2引物进行第二轮PCR扩增验证。PCR扩增条件和PCR产物回收方法同实施例2。PCR产物测序大小为534bp。所得产物即为链格孢Ll α-L-鼠李糖苷酶基因cDNA 5'端序列，测得序列如SEQ ID No. 5。
将上述三个序列拼接，获得2305bp的cDNA全序列，该序列含一个2046bp的0RF， 编码681个氨基酸，其中上述ORF前57bp编码的19个氨基酸为信号肽序列，后1989bp (含终止密码子)编码的663个氨基酸为成熟酶。
该2046bp 的 ORF 即为链格孢 Ll (Alternaria sp. Li) CGMCC No. 3688 的 α -L-鼠李糖苷酶基因编码区cDNA序列，其核苷酸序列及编码的氨基酸序列分别为SEQ ID No. 1和 SEQ ID No. 2。
实施例5 成熟链格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶的基因编码区cDNA序列的扩增
设计引物pPIC9K-F和pPIC9K_R，分别引入能插入pPIC9K质粒(Invitrogen，该质粒载体具有α-factor信号肽序列，可分泌表达蛋白，便于重组蛋白的纯化)的Sna BI.Not I酶切位点(下划线所示)，序列如下
pPIC9K-F 5' -5，-GCCTACGTATCAACGCCCTACTCTC-3’ SEQ ID N0. 19
pPIC9K-R 5' -ACTGCGGCCGCCTCCGAACATCTAAAC-3，SEQ ID N0. 20
以提取的链格孢总RNA为模板，采用上述引物oligo-dT进行反转录合成cDNA第一条链。以cDNA第一条链为模板，用pPIC9K-F和pPIC9K_R引物进行PCR扩增。PCR扩增条件和PCR产物回收方法同实施例2。PCR产物经回收后连接到pMD18-T质粒载体上 (TaKaRa)，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，涂布氨苄青霉素平板，用菌落PCR方法筛选获得重组菌，然后测序，将测得的序列进行分析，显示由1989bp组成，与实施例4结果一致。
实施例6 链格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶基因在毕氏酵母中的表达[0065]将实施例5筛选到的重组菌接种于30mL含100 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养液中，37°C摇床培养，提取重组质粒，加Sna Bi、Not I (NEB)于37°C酶切5小时，回收目的片段，采用同样酶切方法处理PPIC9K质粒载体。将制备好的酶基因片段与PPIC9K载体按一定比例混合，采用连接试剂盒(TaKaRa DNALigation Kit Ver. 2. 0)于16°C连接M小时。 然后采用CaCl2转化法转化宿主菌大肠杆菌DH5 α，转化菌液涂布氨苄青霉素平板，37°C过夜培养。提取阳性菌落质粒，Sal I酶将重组质粒及PPIC9K空质粒线性化，采用电激转化法转化毕氏酵母GS115，转化液涂布MD筛选平板，30°C培养3 4天，挑选生长良好的酵母菌落，采用菌落PCR法验证阳性转化子。将重组质粒阳性转化子及pPIC9K空质粒转化子的单菌落接种于BMGY培养基中，30°C培养至0D_达到2 6，3000转/分离心5分钟收集细胞，弃去上清，用BMMY培养液重悬细胞，250C甲醇诱导表达，每M小时加一次100%甲醇至终浓度0.5% (ν/ν)以保持诱导。测定发酵上清液中鼠李糖苷酶水解活性，将完全符合要求的重组菌作为菌种保存。
上述LB 培养液成分蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，NaCl 7g/L，pH 7. 0 7. 5，121°C 灭菌20分钟；
上述MD筛选平板成分无氨基酸酵母氮源(YNB) 13. 4g/L，生物素4X 10_4g/L，蛋白胨20g/L，琼脂粉15g/L，pH自然，115°C灭菌30分钟；
上述BMGY培养液成分酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB 13. 4g/L，pH6. 0磷酸缓冲液lOOmmol/L，生物素4X10_4g/L，甘油1% (ν/ν), pH自然，115°C灭菌30分钟;
上述BMMY培养液成分酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，YNB 13. 4g/L，pH6. 0磷酸缓冲液 100mmol/L，生物素 4X10_4g/L，甲醇 0. 5% (ν/ν), pH 自然，115°C灭菌 30 分钟。
上述α -L-鼠李糖苷酶水解活性测定
取50 μ L 上清液，加 2mmol/L 的 pNPR 溶液 300 μ L，37 °C 反应 10 分钟，加 300 μ L 0. 005mol/L的Na2CO3溶液终止反应，12，000转/分离心2分钟，上清液测OD4000酶的活力单位规定以1分钟水解PNPR释放1 μ mol对硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位(U)。
实施例7 链格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶基因在毕氏酵母中的表达和纯化
将实施例6所保存的毕氏酵母GSl 15重组菌接种于50mLBMGY培养液，30°C培养M 小时，转接于200mL BMMY培养液培养液，25°C培养，每M小时加入甲醇至终浓度0.5% (ν/ ν)，再继续培养120小时，于3000转/分离心5分钟，获得发酵上清液，即粗酶液。用孔径为0. 22 μ m的滤膜过滤粗酶液，然后用截流分子量为30kDa的膜超滤，即获得到了电泳纯重组α-L-鼠李糖苷酶。
实施例8 链格孢Ll重组α -L-鼠李糖苷酶的基本酶学性质
(1)酶的分子量
酶蛋白分子量的测定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)。根据样品和标准蛋白的PAGE图，测定样品和标准蛋白的相对迁移值&，用标准蛋白的&值对分子量的对数作标准曲线。再根据纯酶样品的&值，就可求得其分子量。SDS-PAGE采用垂直板式不连续系统电泳方式，电泳分离胶浓度为10%，浓缩胶4% ；Nativegradient PAGE (非解离梯度聚丙稀酰胺凝胶电泳)采用5 12%线形梯度垂直板状聚丙烯酰胺凝胶，40C电泳。
Native gradient PAGE显示酶蛋白的分子量约为MO士 10kDa，SDS-PAGE显示酶蛋白单亚基分子量约为120±^Da(如附图1)，表明该酶为一个二亚基蛋白。SDS-PAGE中的条带呈现弥散状态，为糖蛋白的明显特征，其弥散状态是因蛋白分子糖基化不均一导致的， 用糖酰胺酶-F(PNGase F)处理链格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶后再进行SDS-PAGE，其大小为 70 士 5kDa，与预测的分子量大小相近。
(2)酶的动力学参数
酶的动力学参数的测定采用双倒数法。
将5 μ L酶与30 μ L不同浓度的pNPR(浓度范围2 6. 67mmol/L)混合，于37°C反应10分钟，加150 μ L 0. 005mol/L的Na2CO3溶液终止反应，测定OD4tltl,计算水解速率，用双倒数作图法测得酶对PNPR的Km值为1. 27mmol/L。
(3)温度和pH对酶活性的影响
在适当的温度范围(25°C 80°C)内，每5°C为一个梯度测定酶在该温度下的相对酶活。结果表明酶适宜反应的温度为60°C 65°C，最适反应温度为65°C。将酶在上述温度梯度下保温2小时后测定相对酶活。结果表明在25°C 60°C范围内保温池，能够保留 80%以上的活性，60°C以上失活较快，70°C失去所有的酶活。用不同pH的缓冲液配制酶反应体系，测定相对酶活，结果表明酶的最适反应PH为6. 5 7.0 ；酶在不同pH的缓冲液中 4°C保存M小时，测定相对酶活，结果表明酶在pH 3. 5 9. 0范围内稳定。
上述酶活测定方法为5 μ L酶与30 μ L2mmol/L的pNPR溶液混合，于37°C反应10 分钟，加150 μ L 0. 005mol/L的Na2CO3溶液终止反应，测定OD400。
上述不同pH缓冲液为广泛缓冲液pH2. 6 12. 0。每升混合液含柠檬酸6. 008g、 磷酸二氢钾3. 893g、硼酸1. 769g、巴比妥5. 266g，每IOOml混合液滴加χ ml 0. 2mol/LNa0H 溶液至所需PH值。
实施例9 链格孢Ll重组α _L_鼠李糖苷酶用于水解柑橘类果汁的主要苦味物质柚苷
将60yL、10mmol/L柚苷溶液与5yL酶液(酶量0. 05U) 37°C反应10分钟，100°C 煮沸10分钟灭活酶液终止反应。对照反应先将酶液灭活，其余反应体系相同。图2显示了该反应的HPLC分析结果，重组酶在该条件下能够水解24%的柚苷。
上述HPLC分析所用设备及条件安捷伦1200LC高效液相色谱仪；安捷伦VWD紫外检测器；ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱(4. 6mmX 150mm)；流动相为 23% 乙腈，流速为 ImL/ min,柱温25 V ；检测波长为^Onm。样品用0. 22 μ m滤膜过滤后，进样分析。
实施例10 链格孢Ll重组α -L-鼠李糖苷酶以葡萄糖为受体发生转糖基反应
将1(^1^酶液(酶量0.川)、45口1^ 21%鼠李糖、45yL 83%葡萄糖混合，50°C反应 32小时，100°C煮沸10分钟灭活酶液终止反应。对照反应先将酶液灭活，其余反应体系相同。图3显示了该反应的HPLC分析结果，酶在该条件下生成的转糖基产物产量为12.2%。
上述HPLC分析所用设备及条件安捷伦1200LC高效液相色谱仪；安捷伦RID示差折光检测器；ZORBAX Carbohydrate柱(4. 6謹X25(toim)；流动相为70%乙腈，流速为ImL/ min,柱温30°C。样品用0. 22 μ m滤膜过滤后，进样分析。
实施例11 链格孢Ll重组α -L-鼠李糖苷酶与其他来源α -L-鼠李糖苷酶的性质比较
将上述链格孢Ll重组α -L-鼠李糖苷酶氨基酸序列于NCBI网站进行BLAST氨基酸序列比对，结果发现，除各种预测蛋白外，只有三种真菌α-L-鼠李糖苷酶与本专利涉及的链格孢Ll α -L-鼠李糖苷酶序列相似度较高。
参考发表文献(Koseki T, et al. Characterization of an α -L-rhamnosidase from Aspergillus kawachii and its gene.Appl Microbiol Biotechnol,2008, 80 1007-1013 ；Manzanares P, et al. Purification and characterization of two different α-L—rhamnosidases, RhaA and RhaB, from Aspergillus aculeatus. Appl Environ Microbiol, 2001,67 :2230_2234)，将这三种α-L-鼠李糖苷酶与本专利中所说明的链格孢Ll重组α -L-鼠李糖苷酶进行性质比较，表1结果显示链格孢Ll重组α -L-鼠李糖苷酶与已报道的三种酶在氨基酸序列、分子量大小、动力学参数、酶学基本性质如最适 PH及ρΗ稳定性、最适温度等方面均具有显著差异，此外链格孢Ll重组α -L-鼠李糖苷酶具有转糖基活性，其他酶未报道具有转糖基活性。
表1.链格孢Ll重组α _L_鼠李糖苷酶与其他来源α _L_鼠李糖苷酶的性质比较
权利要求
1.一种α -L-鼠李糖苷酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.一种由权利要求
1所述α -L-鼠李糖苷酶基因编码的α -L-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3.—种插入了 SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的表达载体。
4.如权利要求
3所述的表达载体，其特征在于，表达载体为PPIC9K表达载体。
5.一种插入了包含SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No. 1序列表达载体的重组细胞。
6.如权利要求
5所述的重组细胞，其特征在于，重组细胞为毕氏酵母GS115。
7.权利要求
2所述α-L-鼠李糖苷酶在食品、制药领域方面的应用。
8.如权利要求
7所述的应用，其特征在于，步骤如下将α -L-鼠李糖苷酶基因克隆到PPIC9K表达载体上，转化毕氏酵母GS1115 (Pichia pastoris GS115)，甲醇诱导高效表达重组α-L-鼠李糖苷酶，应用该酶水解柑橘类果汁中主要的苦味物质柚苷，或以鼠李糖为供体，甲醇、乙醇、异丙醇、葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、七叶苷为受体进行转糖基反应。
专利摘要
本发明涉及一种α-L-鼠李糖苷酶基因，尤其涉及一种来源于链格孢的α-L-鼠李糖苷酶基因及其应用，属于基因工程技术领域：
。一种α-L-鼠李糖苷酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。由上述α-L-鼠李糖苷酶基因编码的α-L-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所述α-L-鼠李糖苷酶基因克隆到pPIC9K表达载体上，转化毕氏酵母GS115，甲醇诱导表达，发酵液产酶量426mg/L。该α-L-鼠李糖苷酶基因在毕氏酵母中表达的重组酶能够高效水解柑橘类果汁中的主要苦味物质柚苷，并且能够以鼠李糖为供体、多种物质为受体合成转糖基产物，在食品、制药和化工行业有重要的潜在应用价值。
文档编号C12N1/19GKCN102321645SQ201110226051
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月8日
发明者刘倩, 卢丽丽, 肖敏 申请人:山东大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan