专利名称:一种利用rna干扰技术防治烟粉虱的方法
技术领域：
本发明是一种利用RNA干扰技术防治烟粉虱的方法，属于农业生物技术领域：
。
背景技术：
烟粉風Bemisia tabaci (Gennadius)广泛分布于全球除南极洲外的各大洲，是热带、亚热带及相邻温带地区棉花、蔬菜和园林花卉等植物及大田作物的主要害虫之一(Brown et al.，1995)。它不仅取食寄主植物汁液，而且能够传播100多种病毒，分泌大量蜜露诱发煤污病影响光合作用(Liu et al. ,2006 ；Jiu et al.，2007)。烟粉虱也是科技界有史以来唯一被冠以“超级害虫”(superbug)的昆虫，近20年来给世界许多国家农业造成严重的经济损失。烟粉虱在我国广大地区已暴发成灾并造成严重危害，近年来烟粉虱传播的双生病毒在山东、浙江、江苏等地区给番茄等蔬菜造成毁灭性的危害。现在防治烟粉虱的主要手段为化学防治。如公开号为CN1826890A(申请号为200510024189. 9)的中国专利，公开了一种杀灭B型烟粉虱和有害节肢动物的组合物，其特征在于它含有吡丙醚(4-苯氧基苯基(RS)-2-(2-吡啶基氧)丙基醚)和吡虫啉(1-(6_氯-3-吡啶基甲基)-N-硝基亚咪唑烷-2-基胺)两种活性成分，其吡丙醚和吡虫啉两者的重量比在1/0.5至1/25之间。化学农药的大量使用，不仅导致农药残留，破坏了环境与生态系统平衡，而且导致烟粉虱抗药性逐年增强。目前，传统的烟粉虱防治策略难以满足农业生产的需要，急需新的防控手段。
凋亡抑制蛋白(inhibitorof apoptosis protein, IAP)结合并抑制活性caspase的活性，从而阻止细胞死亡，甚至可以调节细胞周期和信号转导(Deveraux and Reed,1999 ；ffei et al. , 2008 ；RumbIe and Duckett, 2008)。通过 RNAi 或 cycloheximide 处理在果蚬S2细胞和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda) Sf21细胞去除IAP蛋白导致快速而广泛的凋亡(Muro et al. ,2002)
RNA干扰(RNA interference, RNAi)应用于农作物遗传改良进行精准抗虫已成为近年来研究的一个热点(Gordon and Waterhouse, 2007 ；Castanotto and Rossi, 2008 ；Price and Gatehouse, 2008),已在鳞翅目和鞘翅目昆虫中试验成功。例如，Mao等(2007)研究发现表达P450基因(CYP6AE14)和谷胱甘肽基因GSTl dsRNA的棉花对取食的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)幼虫诱导了 RNAi,阻碍了幼虫的发育,这一技术为防治农作物害虫提供了新的策略。Baum等(2007)鉴定了玉米根萤叶甲Diabrotica virgiferavirgifera (Le Conte) 290个生长发育相关基因，利用RNAi饲喂该虫幼虫的方法筛选出14个在低dsRNA浓度对昆虫具有致害效应的基因。例如，低浓度的V型ATP酶A基因的dsRNA在摄食24小时内快速下调内源性mRNA，诱发特异性RNAi反应；编码V型ATP酶亚单位和β -微管蛋白的dsRNA能够使昆虫产生系统性基因沉默。这些研究成果表明，RNAi在农作物遗传改良进行精准抗虫方面具有重大的应用前景。
由于烟粉虱为刺吸式昆虫，吸食植物汁液，所以不能直接饲喂烟粉虱dsRNA ;通过注射法也可进行RNA干扰，但不能大量应用于防治烟粉虱，并且由于烟粉虱虫体较小，注射容易损伤烟粉虱，导致其死亡。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用RNA干扰技术防治烟粉虱的方法。
—种利用RNA干扰技术防治烟粉虱的方法，步骤如下
(I)根据烟粉虱的基因序列选取RNAi的靶序列IAP基因，并设计靶序列的PCR扩增引物，上游引物的5’端引入BglII酶切位点，下游引物的5’端引入Xho I酶切位点；
(2)提取烟粉虱的RNA并通过反转录获得cDNA，然后用步骤⑴制得的PCR扩增弓丨物对cDNA中含有的IAP基因的cDNA进行PCR扩增，纯化后制得目的基因；
(3)将步骤(2)制得的目的基因插入到PMD18-T载体中，用BglII和Xho I酶切获得酶切片段，将其反向连接至pUC-RNAi载体，再用BamH I和Sal I酶切获得酶切片段，将其正向连接至pUC-RNAi载体，用Pst I酶切pUC-RNAi载体，回收酶切片段，将其插入用Pst I酶切的表达载体pCAMBIA2300-35S中，制得含有目的基因的表达载体；
(4)将步骤(3)制得的含有目的基因的表达载体转化作物，获得具有防治烟粉虱的转基因作物，种植该作物即可。
所述步骤(I)中的引物，序列如下
上游引物IAP F :5’ -GAAGATCTTCGGCGATGTTCCTTGTTTAG-3，, SEQ ID NO. I
下游引物IAP R :5’ -CCGCTCGAGCGGACTGAGATGATTCCGAGAC-3，, SEQ ID NO. 2，上游引物的5’端引入BglII酶切位点，下游引物的5’端引入Xho I酶切位点(如下划线所示)。
所述步骤⑵中PCR扩增体系为2 μ I cDNA，20yM引物0·5μ 1(上游引物与下游引物浓度分别为2(^] )，5~4 1 Taq酶O. 5 μ 1，IOXTaq Buffer 5 μ I, IOmM dNTP I μ I,补ddH20至总体积50 μ I ;
PCR扩增扩增条件为94°C变性lmin，5rC退火lmin，72°C延伸lmin，共30个循环，72°C延伸7min,4°C保温。
所述步骤⑷中的转化为叶盘法转化。
所述作物为烟草(Nicotianatabacum) Nc89。
步骤(I)中所述烟粉風的基因序列可参考Leshkowitz et al. (2006)；Whitefly (Bemisia tabaci) genome pro ject中的附件I的相关论述(该论文可登陆如下网址查看 http: //www. ncbi. nlm. nih. Rov/pmc/articles/PMC1488848/ tool = pubmed)。
上述方法的专用引物，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
上述步骤中，如无特别说明，均可采用本领域常规技术，步骤(3)中将目的基因插入到pMD18-T载体、将酶切后的片段反向连接至pUC-RNAi载体、将酶切后的片段正向连接至pUC-RNAi载体、将酶切后的片段插入用Pst I酶切的表达载体pCAMBIA2300-35S的具体操作步骤也可参见PMD18-T载体、pUC-RNAi载体、pCAMBIA2300_35S载体的使用说明书。
有益效果
(I)本发明中通过筛选目的基因IAP基因，然后设计引物构建含有IAP基因的转基因作物表达载体，然后将该表达载体转染到作物中，生物学研究表明转基因作物可导致50-70%烟粉虱死亡，为烟粉虱的防治提供了新的方法。
(2)本发明对于利用RNAi技术研究烟粉虱的基因功能、利用RNAi技术防治烟粉虱和转基因植物防治烟粉虱具有重要的指导价值和理论意义。本发明是对以农药为主的防治烟粉虱的有益补充，为烟粉虱防治提供新的策略。
(3)通过饲喂表达IAP基因的转基因植物来沉默特定基因进而控制害虫，符合烟粉虱的习性，为农业害虫防治领域提供理论依据和实验支持，迄今国内外尚无同类研究报道。表达IAP dsRNA基因的转基因植物诱导害虫RNAi实现转基因植物抗害虫技术，可推广到其它病害(包括病毒、细菌、真菌和昆虫)，从而建立全面的农作物改良分子调控技术体系。从这一思路出发，在将来的研究中针对灾区害虫的实际情况，选择害虫的高度保守序列及与生命活动相关的关键基因，利用本发明的分子调控技术体系，实现控制害虫的目的。因此，本发明具有较为广阔的应用前景。
图I是PCR扩增IAP基因片段；
其中M, Marker DL2000 ;1，PCR扩增的IAP基因片段；2，PCR扩增的IAP基因片段；3，PCR扩增的IAP基因片段；4，PCR扩增的IAP基因片段；5，PCR扩增的IAP基因片段；6，PCR扩增的IAP基因片段；
图2是载体pCAMBIA2300-35S中表达IAP-dsRNA的发夹结构；
图3是Pst I酶切表达载体pCAMBIA2300-35S进行验证；
其中M，Marker DL2000 ;l，Pst I酶切表达载体的片段；2，Pst I酶切表达载体的片段；3，Pst I酶切表达载体的片段；4，Pst I酶切表达载体的片段；
图4是检测转基因烟草的IAP基因在RNA水平的表达；
其中M，Marker DL2000 ;1，转基因烟草；2，正常烟草；
图5是检测转基因烟草的IAP基因在DNA水平的表达；
其中M，Marker DL2000 ;1，转基因烟草；2，转基因烟草；3，转基因烟草；4，转基因烟草；5，转基因烟草；6，转基因烟草；7，转基因烟草；8，转基因烟草；9，正常烟草；10，正常烟草；11，正常烟草；12，正常烟草；
图6是检测饲喂转基因烟草对烟粉虱IAP基因表达影响的电泳图；
图7是检测饲喂转基因烟草对烟粉虱IAP基因表达影响的直方图；其中*:P< O. 05 ；
图8是检测饲喂转基因烟草对烟粉虱死亡率的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护内容不仅限于此。
实施例中的pMD18-T载体购于TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；PCAMBIA2300-35S表达载体购自CAMBIA公司；pUC_RNAi载体可为市售产品，本实施例中根据如下文献制得Chen S, Hofius D, Sonnewald U,Bo+.rnke F (2003) Temporal and spatialcontrol of gene silencing in transgenic plants by inducible expression of double-stranded RNA. Plant J 36 :731_740 ;烟草种子Nc89购自中国农业科学院烟草研究所。
实施例I[0041]一种利用RNA干扰技术防治烟粉虱的方法，步骤如下
(I)根据 Leshkowitz et al. (2006) Whitefly (Bemisia tabaci) genome project中的附件I选取RNAi的靶序列IAP基因，并设计靶序列的PCR扩增引物，上游引物的5’端引入BglII酶切位点，下游引物的5’端引入Xho I酶切位点。
引物序列如下IAPF :5’ -GAAGATCTTCGGCGATGTTCCTTGTTTAG-3，, IAP R 5 -CCGCTCGAGCGGACTGAGATGATTCCGAGAC-3’，上下游引物的5’端各引入BglII和Xho I位点(下划线)。
(2)收集烟粉虱，按TaKaRa RNAiso Plus说明书提取其RNA，用MBI公司的反转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, #K1622)反转录合成 cDNA 第一链。
PCR反应体系为2 μ I。0嫩，引物2(^] 各0.5 4 1，5“4 1 Taq酶O. 5 μ 1，IOXTaqBuffer 5 μ 1，IOmM dNTP I μ 1，补 ddH20 至总体积 50 μ I ;
PCR反应条件为94°C变性lmin，51°C退火lmin，72°C延伸lmin，共30个循环，72°C延伸7min，4°C保温；经电泳纯化后制得目的基因；结果如图I所示。
(3)将目的基因的PCR片段插入到pMD18-T载体中(条件步骤参见pMD18_T载体的产品说明书)，用BglII和Xho I内切酶酶切，获得大约441bp左右的片段，将其反向连接至pUC-RNAi载体(条件步骤参见pMD18-T载体的产品说明书)，再用BamH I和Sal I内切酶酶切，获得大约470bp左右的片段，将其正向连接至pUC-RNAi载体(条件步骤参见pMD18_T载体的产品说明书)，用Pst I内切酶酶切pUC-RNAi载体，获得1132bp左右的片段，回收酶切片段，将其插入用Pst I内切酶酶切的表达载体pCAMBIA2300-35S(购自CAMBIA，Canberra，Australia,可登陆网址www. cambia. org购买)中(条件步骤参见pMD18_T载体的产品说明书)，并进行酶切验证(如图2和图3所示)，制得含有目的基因的表达载体；
通过Pst I酶切含有目的基因的表达载体，获得1132bp的片段，与预期相符，表明含有目的基因的表达载体构建成功。
(4)将步骤(3)制得的含有目的基因的表达载体叶盘法转化烟草Nc89，提取抗性苗DNA，进行目的基因PCR检测(图4和图5)。
叶盘法转化烟草Nc89为本领域常用技术，可参考如下步骤
I)烟草种子于70 %乙醇消毒30秒，无菌水冲洗3次，然后用10% H2O2消毒10分钟，无菌水冲洗5次，播种于MS基本培养基中，至5-6片真叶期，备用；
2)挑取农杆菌单菌落接种于含有50mg/L链霉素(Sm)、25mg/L利福平(Rif)、50mg/L卡那霉素(Km)的LB培养基中，28°C，200rpm，振荡培养24小时后，将菌液用1/2MS培养液稀释至OD6tltl = O. 2，待用；
3)取烟草叶片，切成小块(O. 5X0. 5cm2)。
4)将切好的烟草叶片，置于MS分化培养基中，28°C，光照时间16小时/天，光照强度2000LX，预培养两天；
5)将预培养后的烟草叶片浸入菌液5-10分钟；然后用灭菌的滤纸吸干多余菌液，接入MS分化培养基；暗培养，28 0C，共培养2天；
6)共培养后的外植体先用含头孢霉素250mg/L的无菌水洗涤3次，再用含头孢霉素300mg/L的MS培养液洗I次，然后用灭菌滤纸吸干，转入含头孢霉素300mg/L的MS分化培养,恒温恢复培养(条件同预培养)3天；
7)恢复培养的外植体转到MS筛选培养基上恒温培养,每15天更换一次培养基；
8)待芽长至Icm左右时，切下，移入MS生根培养基中，促其生根；
9)待转基因烟草长至3-4片叶时，将其叶片切下，置于MS分化培养基中，扩繁；待根系发育好后(5-6片真叶)，移入盛有无菌土的花盆中，用地膜保湿2天后，温室常规管理。
对转基因烟草的IAP基 因分别在RNA和DNA水平进行检测，转基因烟草的DNA水平有IAP基因的表达，说明转基因烟草的IAP基因的表达载体成功转入烟草中，叶盘法转基因成功；转基因烟草的RNA水平没有IAP基因的表达，说明转基因烟草中无IAP RNA，不会影响烟草的性状。
转基因烟草防治烟粉虱的效果检测参照Pascual和Callejas (2003)方法(Pascual S, Callejas C(2004) · Intra-and interspecific competition betweenbiotypes B and Q of Bemisia tabaci(Hemiptera Aleyrodidae)from Spain.BullEntomol Res 94 =369-375.)，以饲喂正常烟草叶片的烟粉虱为对照，观察饲喂转基因烟草叶片的烟粉虱情况(图6、图7和图8)。
饲喂烟粉虱转基因烟草后，烟粉虱的IAP基因的表达水平明显降低，表明RNA干扰沉默了 IAP基因的表达；饲喂转基因烟草的烟粉虱死亡率远远高于对照组，表明转基因烟草具有防治烟粉虱的作用。
本发明所保护的技术方案并不仅限于上述实施例，本领域技术人员根据本实施例记载的内容，不经过创造性劳动对其进行部分修改，也同样落入本发明的保护范围。如可将实施例中的方法应用于番茄、茄子、棉花等植物中，也能达到本发明所要求的技术效果。
权利要求
1.一种利用RNA干扰技术防治烟粉虱的方法，步骤如下 (1)根据烟粉虱的基因序列选取RNAi的靶序列基因，并设计靶序列的PCR扩增引物，上游引物的5’端引入II酶切位点，下游引物的5’端引入通0 I酶切位点； (2)提取烟粉虱的RNA并通过反转录获得cDNA，然后用步骤(I)制得的PCR扩增引物对cDNA中含有的IAP基因的cDNA进行PCR扩增，纯化后制得目的基因； (3)将步骤(2)制得的目的基因插入到pMD18-T载体中，用汝·7II和通ο I酶切获得酶切片段，将其反向连接至pUC-RNAi载体，再用B論I和Sal I酶切获得酶切片段，将其正向连接至pUC-RNAi载体，用Pst I酶切pUC-RNAi载体，回收酶切片段，将其插入用Pst I酶切的表达载体PCAMBIA2300-35S中，制得含有目的基因的表达载体； (4)将步骤(3)制得的含有目的基因的表达载体转化作物，获得具有防治烟粉虱的转基因作物，种植该作物即可； 所述步骤(I)中的引物，序列如下 上游引物GAAGATCTTCGGCGATGTTCCTTGITTAG， 下游引物CCGCTCGAGCGGACTGAGATGATTCCGAGAC。
2.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR扩增体系为
2 μ I cDNA, 20 μ M引物O. 5 μ 1，5 U/μ I Taq酶O. 5 μ 1,10 X Taq Buffer 5 μ I,10 mM dNTP I μ 1，补 ddH20 至总体积 50 μ I ; PCR扩增扩增条件为94°C变性I min，51°C退火I min，72°C延伸I min，共30个循环，72°C 延伸 7 min，4°C 保温。
3.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的转化为叶盘法转化。
4.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述作物为烟草Nc89。
5.一种权利要求
I所述方法的专用引物，其特征在于，上游引物核苷酸序列如SEQ IDNO. I所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
专利摘要
本发明是一种利用RNA干扰技术防治烟粉虱的方法，属于农业生物技术领域：
。该方法，步骤如下(1)根据烟粉虱的基因序列选取RNAi的靶序列IAP基因，并设计靶序列的PCR扩增引物；(2)提取烟粉虱的RNA并通过反转录获得cDNA，然后PCR扩增cDNA，纯化后制得目的基因；(3)将目的基因插入到表达载体，制得含有目的基因的表达载体；(4)将含有目的基因的表达载体转化作物，获得具有防治烟粉虱的转基因作物，种植该作物即可。本发明对于利用RNAi技术研究烟粉虱的基因功能、利用RNAi技术防治烟粉虱和转基因植物防治烟粉虱具有重要的指导价值和理论意义。
文档编号C12N15/63GKCN102212522 B发布类型授权 专利申请号CN 201110110537
公开日2012年8月22日 申请日期2011年4月29日
发明者刘国霞, 夏晗, 安立国, 毕玉平, 王兴军, 范仲学, 褚栋, 郭强, 陶云荔 申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),