专利名称:一种单条线虫dna的快速提取方法
技术领域：
本发明涉及线虫DNA的提取，具体涉及一种单条线虫DNA的快速提取方法。
背景技术：
线虫是动物界中数量最丰富者之一，寄生于动、植物，或自有生活于土壤、淡水和海水环境中。其中松材线虫Bursaphelenchus xylophiIus、椰子红环腐线虫汉cocophilus、菊花滑刃线虫 Aphelenchoides ri tzemabosi > 马铃薯金线虫 Globoderarostochiensis等线虫，由于对农业、林业等经济生产生活都具有严重的危害，易造成巨大经济损失，是我国重要的检疫性线虫。由于线虫体形较小，形态学鉴定十分困难，分子生物学方法已成为十分有效的鉴定手段。线虫的分子生物学鉴定需要制备用于PCR反应的DNA模板，早期方法用SDS破壁结合氯仿去除蛋白及其他杂质，提取线虫DNA。如公开号为CN101580830的发明专利申请，就公开了裂解液冻融、蛋白酶K消化、氯仿提取等技 术，但提取时间长、操作繁琐，所用试剂多、价格贵，不利于快速检测。所以部分学者寻求简捷的方法包括微型搅拌器破碎法、研磨法、手工切断法、超声波匀浆法等，如公开号为CN100487435的发明专利，就公开了线虫用双蒸水清洗后，直接机械破碎于检测试剂中，通过滤纸吸附后，95°C加热，离心，再PCR反应和检测，该方法虽然快速，操作方便；但该方法需提取与检测一起完成，非独立快速提取DNA，所以DNA模板无法备份，且仅对松树萎蔫病原线虫有效，也无法通用；该方法提取时样品损失较大，只是在破碎压制时少量吸附于滤纸的DNA和引物进行PCR反应和检测，DNA提取效率低，手工破碎也易造成污染；也未降解蛋白质和酶类等杂质，所以会影响检测的准确性。综上所述，目前还未公开一种快速、高效、纯度高、污染少、通用的单条线虫DNA的提取方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种通用、杂质少、纯度高、污染少、快速、高效、DNA模板备份量较多的单条线虫DNA的快速提取方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种单条线虫DNA的快速提取方法，包括下述步骤
a、线虫洗涤在灭菌的洁净载玻片上滴加灭菌的双蒸水，用灭菌的O号针将单条线虫挑入所述双蒸水中洗涤；
b、线虫转移上述单条线虫洗涤后，再将线虫挑入灭菌的200 UL PCR管中，所述PCR管内含8 μ L双蒸水和I yL的10XPCR Buffer溶液，然后13000 rpm离心I min ;10XPCR Buffer 溶液(Mg2+ free):包括 ρΗ8· 3 的 Tris-HCl 溶液 100 mM, KCl 溶液 500mM :购于TaKaRa公司；
C、破坏线虫表皮细胞离心后，将所述PCR管置于液氮中速冷I min，取出后立即在85 °C条件下恒温2 min，再立即将PCR管的温度速降至56 °C，恒温30 sec ;此变温过程需在PCR仪中设置程序，并按照程序操作完成，在冷热剧烈变化下使线虫体壁细胞破裂，效果明显；
d、DNA释放在上述56°C恒温后的PCR管中加入浓度为I mg/mL的蛋白酶K(购自TaKaRa公司)1 μ L，先在56°C下恒温15 min，再在95°C条件下恒温10 min，得到DNA提取液，-20°C保存备用。蛋白酶K可以消化线虫细胞，释放DNA，56°C为其最适作用温度，95°C为了使蛋白酶K失活以免影响之后的PCR扩增反应，效果很好。
与现有技术相比，本发明的优点在于一种快速、高效、适用范围广的单条线虫DNA提取方法，使用PCR Buffer溶液代替WLB裂解液和SDS裂解液，减少了溶液配置的不确定性和外来离子的影响；通过冷热剧烈变化使线虫体壁细胞破裂；用蛋白酶K消化线虫细胞，释放DNA ;整个提取过程在一个PCR管中完成，并可直接用于PCR扩增，没有溶液的转移和过多的溶质添加，减少污染及对后续PCR的影响；本发明使用变温处理代替其他手工破碎方法，不需要操作技巧，减少了外界污染物的掺入，使用液氮处理，缩短了处理时间；可以对 单条线虫提取的DNA稀释32倍进行PCR扩增反应检测，通过对16种不同种线虫进行DNA提取，PCR扩增反应检测，结果稳定。该方法可通用于对单条线虫进行提取和鉴定，及进一步的序列分析。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例I
一种单条松材线虫DNA的快速提取方法，在灭菌的洁净载玻片上滴加适量灭菌的双蒸水，用灭菌的O号针将单条松材线虫挑入双蒸水中洗涤；该松材线虫洗涤后，再将松材线虫挑入灭菌的200 μ L PCR管中，PCR管内预装有8 μ L双蒸水和I yL的10XPCRBuffer溶液(Mg2+ free),然后13000 rpm离心I min ;离心后,将PCR管置于液氮中速冷Imin,取出，立即在85°C条件下恒温2 min,再将PCR管的温度速降至56°C,恒温30 sec ;在上述56°C恒温后的PCR管中加入浓度为I mg/mL的蛋白酶K溶液I μ L，先在56°C下恒温15 min，再在95°C条件下恒温10 min，得到松材线虫DNA提取液，_20°C保存备用。
实施例2
与实施例I基本相同，所不同的只是松材线虫由椰子红环腐线虫替代，得到的是椰子红环腐线虫DNA提取液。
实施例3
与实施例I基本相同，所不同的只是松材线虫由马铃薯金线虫替代，得到的是马铃薯金线虫DNA提取液。
实施例4
与实施例I基本相同，所不同的只是松材线虫由菊花滑刃线虫替代，得到的是菊花滑刃线虫DNA提取液。
上述实施例只是对本明的说明，其它线虫的DNA提取方法同上都可实现，在此不一一列举，本明的的方法对线虫具有通用性，我们共对16种不同种线虫进行DNA提取，都具有杂质少、纯度高、污染少、快速、高效的优点，并对各种的DNA提取液32倍稀释进行PCR扩增反应检测验证，结果都稳定，灵敏。
权利要求
1.一种单条线虫DNA的快速提取方法，其特征在于包括下述步骤a线虫洗涤在灭菌的洁净载玻片上滴加灭菌的双蒸水，用灭菌的O号针将单条线虫挑入所述双蒸水中洗涤； b线虫转移上述单条线虫洗涤后，再将线虫挑入灭菌的200 uL PCR管中，所述PCR管内含8 μ 双蒸水和I yL 10XPCR Buffer溶液，然后13000 rpm离心I min，所述10XPCRBuffer 溶液为无 Mg2+ 的 10XPCR Buffer 溶液，其含有 pH8. 3 的 Tris-HCl 溶液 100 mM,KCl 溶液 500 mM ； c破坏线虫表皮细胞离心后，将所述PCR管置于液氮中速冷I min，取出后立即在85°C条件下恒温2 min,再立即将PCR管的温度速降至56°C,恒温30 sec ； d DNA释放在上述56°C恒温后的PCR管中加入I μ L浓度为I mg/mL的蛋白酶K，先在56°C下恒温15 min，再在95°C条件下恒温10 min，得到DNA提取液，_20°C保存备用。
专利摘要
本发明公开了一种快速、高效、适用范围广的单条线虫DNA提取方法，使用PCRBuffer溶液代替WLB裂解液和SDS裂解液，减少了溶液配置的不确定性和外来离子的影响；通过冷热剧烈变化使线虫体壁细胞破裂；用蛋白酶K消化线虫细胞，释放DNA；整个提取过程在一个PCR管中完成，并可直接用于PCR扩增，没有溶液的转移和过多的溶质添加，减少污染及对后续PCR的影响；本发明使用变温处理代替其他手工破碎方法，不需要操作技巧，减少了外界污染物的掺入，使用液氮处理，缩短了处理时间；可以对单条线虫提取的DNA稀释32倍进行PCR扩增反应检测。
文档编号C12N15/10GKCN102161989 B发布类型授权 专利申请号CN 201110049172
公开日2013年1月16日 申请日期2011年3月2日
发明者顾建锋, 王江岭, 张建成 申请人:宁波检验检疫科学技术研究院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非专利引用 (3),