专利名称:液态β-淀粉酶制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及酶制剂的制备方法，具体涉及利用植物制备液态β -淀粉酶制剂的制
备方法。
背景技术：
β-淀粉酶(又称0-1，4_0葡聚糖麦芽糖水解酶工.(.3.2. 1.2)是一种外切型淀 粉水解酶，它能从淀粉的非还原性末端开始，依次催化水解α _1，4-D葡萄糖苷键，生成麦 芽糖。与此同时，发生瓦尔登转位反应(Waldeninversion)，使产物由α-型变为β-型，故 称β-淀粉酶。
由于β _淀粉酶不能水解支链淀粉的α -1，6键，也不能跨过分支点α _1，6键而 切开内部的α-1，4键和α-1，6键附近的2 3个α-1，4键，所以在水解产物中残留下侧 支外常挂有2 3个葡萄糖残基的β-极限糊精。β-淀粉酶即使作用于直链淀粉时，也只 能使淀粉的70% 90%水解成麦芽糖，其它为麦芽三糖和寡糖。β-淀粉酶在工业上是一 种重要的酶，它可把淀粉质原料转化成麦芽糖，含量不同的麦芽糖产品可以用于如糖果、啤 酒发酵等食品工业，高纯度的麦芽糖液还可替代葡萄糖输液用于糖尿病人。
在目前已有报道的生产技术中，有用微生物发酵法生产的商品淀粉酶，此酶 耐热稳定性能差，除产生麦芽糖外，还产生相当量的麦芽三糖，而植物β “淀粉酶耐热稳定 性好，作用PH范围广，能产生较多的麦芽糖。但现有从植物中提取的淀粉酶都是固体 产品，为粗制品杂质含量高，不能作为食品添加剂(见专利公开号CN1225943A大豆β-淀 粉酶的制备工艺)，并在制备过程中采用盐析工艺，硫酸钠回收困难，存在废液处理问题。反 复冻融使操作复杂，成本高。而专利《提取β-淀粉酶的方法》(见专利公开号CN1491279A) 仅提供了采用纤维素酶从大麦或小麦中提取淀粉酶，但纤维素酶价格高，生产成本高。 到目前为止，由于缺乏有效的制备工艺，高酶活力的液体植物β -淀粉酶制剂仍未实现工 业化规模生产。
发明内容
针对上述现有β-淀粉酶制备方法存在生产成本高、产品杂质含量高以及废液 处理等问题，本申请人提供一种液态β “淀粉酶制剂的制备方法。
本发明的技术方案如下
液态β -淀粉酶制剂的制备方法，其工艺步骤包括
以麸皮为原料，其工艺步骤包括麸皮的浸提、固液分离、浸提液的精滤、超滤浓缩、 配方、二次精滤、酶活力调整，分述如下
浸提
(1)配制浸提水在水中按(重量/体积)加入防腐剂对羟基苯甲酸乙酯0. 01 0. 03%、山梨酸钾0. 1 0. 25%、苯甲酸钠0.2 0.5%，还原剂焦亚硫酸钠0.5 1.5%、 低亚硫酸钠0.5 1.5% ；[0011](2)浸提将麸皮按(重量/体积)1 4 7加入步骤⑴配制的浸提水；常压 下，浸提温度控制在40 55°C，pH控制在4. 5 6. 5，浸提6 8小时；
固液分离浸提后进行固液分离。
精滤分离出的浸提液迅速冷到20°C以下，分离出的浸提液加入1 2% (重量/ 体积)的硅藻土，过精滤板框进行精滤；
超滤浓缩所得精滤液进行超滤浓缩，超滤浓缩的温度控制在20°C以下；
配方超滤浓缩到所需规格的酶活力要求后，将所得超滤浓缩液放入配方罐，按 (重量/体积)加入稳定剂18 22%的氯化钠、8 10%的醋酸钠、5 8%麦芽糊精、
0.1 0. 25%的山梨酸钾、0.2 0.5%苯甲酸钠，搅拌溶解，混合均勻；
二次精滤所得配方液中加入1 2% (重量/体积)的硅藻土，过精滤板框进行 精滤。
酶活力调整收集二次精滤的滤液，取样作成品检验，用稀释液将二次精滤滤液的 酶活力调整到300000U/g或600000U/g。
所述酶活力调整所用的稀释液是按(重量/体积)加入稳定剂18 22%的氯化 钠、8 10%的醋酸钠、5 8%麦芽糊精、0. 1 0. 25%的山梨酸钾、0. 2 0. 5%苯甲酸钠 的水溶液。
根据上述制备工艺生产出的300000U/g、600000U/g液态植物β -淀粉酶制剂，产 品为棕褐色液体、无异味、可以与水互溶，产品热稳定性好、催化活性强，最适合作用温度在 55°C 60°C之间。当温度超过65°C时，反应速度加快，但失活也加快。本品最适合作用pH 值范围为5.0 6. 8之间。本产品中不含α-淀粉酶。
本发明所得成品能达到以下指标酶活力300000U/g、600000U/g，容重1. 15
1.25g/ml, ρΗ5· 0 6· 0，菌落总数彡10000cfu/mlo活力保存稳定性极高，在25°C以下，保 存6个月之后酶活力仍大于90%。
以上工艺的总酶活回收率>74%，上述工艺与指标均优于用其它技术得到的酶制 剂制品。本发明是全新的液态淀粉酶制剂制备工艺，工艺简单、生产效率高、生产成本 低，适合于工业化生产。
本发明以麸皮为原料，生产成本低；在液态淀粉酶制剂的生产过程中，由于工 序时间长，容易腐败，引起酶的失活，本发明采用合适配比的防腐剂以及合适的温度和ρΗ， 能够有效的抑制细菌生长，防止腐败以及酶的失活；本发明是一种液态的淀粉酶制剂， 相对于固体酶制剂而言所含的工业盐浓度低，易达到食品级标准要求；在生产过程中，温度 只需控制在20°C以下，降低了生产能耗；本发明采用精滤-超滤浓缩-二次精滤的步骤，所 得的产品杂质含量低，达到食品添加剂标准的要求；分离后的麸皮经干燥后可作饲料，无废 固物处理问题。
图1为本发明的工艺流程图；
图2为用于酶活力测定的DNS半量法标准曲线图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步说明
实施例1
1、浸提
(1)配制浸提水250L水中加入防腐剂对羟基苯甲酸乙酯0.02^(g、山梨酸钾 0. 62^(g、苯甲酸钠0. 87^(g、还原剂焦亚硫酸钠1. 25Kg、低亚硫酸钠3. 75Kg，搅拌溶解；
(2)浸提称取50Kg麸皮加入步骤⑴配制的浸提水中；常压下，水浴升温至45°C 保温，调pH为4. 5，每小时搅动一次，浸提6小时；
2、固液分离浸提后用板框或螺杆压榨机进行固液分离；
3、精滤分离出的浸提液迅速冷到20°C以下，浸提液加入3. 75Kg的硅藻土，过精 滤板框进行精滤；
4、超滤浓缩步骤3所得精滤液进入超滤浓缩器进行超滤浓缩，超滤浓缩的温度 控制在20°C以下，超滤浓缩所采用的为4英寸卷式膜，截流分子量为IOK道尔顿；
5、配方超滤浓缩到酶活力在390000U/g时放出，得到约6. 14L超滤浓缩液，置 于配方罐，加入1105g的氯化钠、491g的醋酸钠、307g麦芽糊精、防腐剂6. 14g山梨酸钾、 12. 28g苯甲酸钠溶解，搅拌均勻。
6、二次精滤在配方液中加入79. 8g硅藻土，搅拌均勻过滤。得成品7. 2^(g，酶活 力 320000U/g，收率 77%。
7、酶活力调整收集二次精滤的滤液，取样作成品检验，测得容重1. 18g/ml, PH5.5，菌落总数彡10000cfu/mL·用稀释液进行酶活力调整，所用稀释液是按(重量/体 积)加入稳定剂18 22%的氯化钠、8 10%的醋酸钠、5 8%麦芽糊精、0. 1 0. 25% 的山梨酸钾、0. 2 0. 5%苯甲酸钠的水溶液，将酶活力调整到300000U/g。
实施例2
1、浸提
(1)配制浸提水7000L水中加入防腐剂对羟基苯甲酸乙酯1.4Kg、山梨酸钾14Kg、 苯甲酸钠14Kg、还原剂焦亚硫酸钠70Kg、低亚硫酸钠70Kg，搅拌溶解；
(2)浸提称取IOOOKg麸皮加入步骤(1)配制的浸提水中；常压下，水浴升温至 55°C保温，调pH为5. 0，每小时搅动一次，浸提7小时；
2、固液分离浸提后用板框或螺杆压榨机进行固液分离；
3、精滤分离出的浸提液迅速冷到20°C以下，浸提液加入84Kg的硅藻土，过精滤 板框进行精滤；
4、超滤浓缩步骤3所得精滤液进行超滤浓缩，超滤浓缩的温度控制在20°C以下， 超滤浓缩所采用的为8英寸卷式膜，截流分子量为20K道尔顿；
5、配方超滤浓缩到酶活力在780000U/g时放出，得到59. 6L超滤浓缩液，置于配 方罐加入12. 49kg的氯化钠、5. 62kg的醋酸钠、4. Ikg麦芽糊精、防腐剂:125g山梨酸钾、 219g苯甲酸钠溶解，搅拌均勻。
6、二次精滤在配方液中加入0.9kg硅藻土，搅拌均勻过滤。得成品70.2^g，酶 活力 632000U/g，收率 74%。
7、酶活力调整收集二次精滤的滤液，取样作成品检验，测得容重1. 17g/ml,PH5. 6，菌落总数≤10000cfu/mlo将酶活力调整到600000U/g，所用稀释液与实施例1相同。
实施例3
1、浸提
(1)配制浸提水30000L水中加入防腐剂对羟基苯甲酸乙酯9Kg、山梨酸钾30Kg、 苯甲酸钠150Kg、还原剂焦亚硫酸钠450Kg、低亚硫酸钠150Kg，搅拌溶解；
(2)浸提称取5000Kg麸皮加入步骤⑴配制的浸提水中；常压下，水浴升温至 50°C保温，调pH为6. 5，每小时搅动一次，浸提8小时；
2、固液分离浸提后用板框或螺杆压榨机进行固液分离；
3、精滤分离出的浸提液迅速冷到20°C以下，浸提液加入84Kg的硅藻土，过精滤 板框进行精滤；
4、超滤浓缩步骤3所得精滤液进行超滤浓缩，超滤浓缩的温度控制在20°C以下， 超滤浓缩所采用的为8英寸卷式膜，截流分子量为60K道尔顿；
5、配方超滤浓缩到酶活力在780000U/g时放出，得到309. 03L超滤浓缩液，置于 配方罐，加入67. 98kg的氯化钠、30. 9kg的醋酸钠、24. 72kg麦芽糊精，防腐剂618g山梨酸 钾、1. 54kg苯甲酸钠溶解，搅拌均勻。
6、二次精滤在配方液中加入3. 71kg硅藻土，搅拌均勻过滤。得成品370. ^g，酶 活力 615000U/g，收率 75. 7%0
7、酶活力调整收集二次精滤的滤液，取样作成品检验，测得容重1.20g/ml， pH5. 4，菌落总数彡lOOOOcfu/ml。将酶活力调整到600000U/g，所用稀释液与实施例1相同。
实施例1-3所得的产品，其酶活力测定方法如下
β -淀粉酶酶活力的测定，依据行业惯用测定方法，采取DNS半量法测定。
麸皮中β -淀粉酶总酶活力的测定，称取50g麸皮置于烧杯中。取200ml水加入 对羟基苯甲酸乙酯0. 02g、山梨酸钾0. 2g、苯甲酸钠0. 4g，还原剂焦亚硫酸钠lg、低亚硫酸 钠Ig搅拌溶解，调PH4. 5。倒入置麸皮的烧杯中搅拌混合。水浴升温至40°C保温每小时搅 动一次浸提8小时。滤纸过滤，滤液用下面描述的方法测定酶活力。本说明书中酶活力均 由该方法测定得到。
酶活力定义在pH5. 50，温度60°C的条件下，每小时水解1. 10%淀粉液所产生Img 麦芽糖所需的酶量为一个酶活力单位(u/g或u/ml)。
酶活力测定(DNS半量法)
1 试剂
1. 10. 2M, ρΗ5· 50 磷酸缓冲液
甲液称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 · 12H20)53. 65g，用蒸馏水溶解定容至1000ml。
乙液称取磷酸二氢钠(NaH2PO4 · 12H20)27. 8g，用蒸馏水溶解定容至1000ml。
取甲液6. 5ml,乙液93. 5ml，混合后以酸度计校正pH5. 50即成。
1. 210% ρΗ5· 50 磷酸缓冲液
取上述0. 2Μ，ρΗ5. 50磷酸缓冲液10ml，加入90ml蒸馏水，混合即成。
1. 3DNS 溶液
精确称取3. 5- 二硝基水杨酸1. OOOOg,苯酚0. 2g，亚硫酸钠0. 05g,氢氧化钠lg，酒石酸钾钠20g，用蒸馏水加热溶解，冷却定容至100ml，于棕色瓶中贮存，放置一周后方能 绘制标准曲线(每次配制需绘制)。
1.41. 淀粉缓冲液
煮沸约50ml蒸馏水，加入到1. Ig淀粉的少量蒸馏水溶解液中，再煮沸至透明，冷 却，
力口IOmUO. 2M，ρΗ5· 50 磷酸缓冲液，定容至 100ml。
2仪器和设备
2. 1 恒温水浴 0 100°C (精度士0. 2°C )
2. 2 秒表
2. 325ml具塞比色管
2. 4移液管
2. 5容量瓶
3标准曲线的绘线(DNS半量法)
准确称取于(105 110°C )干燥后的葡萄糖50mg，用蒸馏水溶解定容至50ml，配 成lmg/ml葡萄糖液，按表一比例操作及开水煮沸15min，冷却，加入10. 5ml蒸馏水，722型 分光光度计550nm比色。
表一
编号含葡萄糖 (mg)lmg/ml葡萄糖液 (ml)蒸馏水 (ml)DNS液 (ml)10. 10.10.41.5 .20.20.20.31.530. 30.30.21.540.40.40. 11.550.50.501.5对照用0. 5ml蒸馏水代替葡萄糖溶液
见图2，以OD值为纵坐标，葡萄糖mg数为横坐标，绘制标准曲线图(用回归方程算 出常数K(K=葡萄糖mg/OD)。样品根据所测定的OD值，在标准曲线上查出其相当于葡萄糖 mg数，再乘以1.9倍，即为麦芽糖mg数。
4测定步骤
4. 1样品制备
准确称取一定量酶样，用10%磷酸缓冲液溶解定容、摇勻。(每mg酶液约20单位 为宜，OD值控制在0. 2 0. 4之间)。
4. 2 测定
a.准确吸取1. 4溶液9. 0ml，于60°C恒温水浴预热5min，加入Iml酶样，立即计时 准确反应30min。
b.迅速吸取0. 5ml反应液于已吸入DNS试剂1. 50ml的25ml具塞比色管中，煮沸15min，冷却。再加入10. 50ml蒸馏水，摇勻。用550nm比色。对照以蒸馏水替代酶样，其 它操作同。
4. 3 计算
酶活力单位u/mg = 0DX2X20X1. 9XKXn = 0DXKX76Xn
式中K—标准曲线常数
η—样品稀释倍数
2-反应 30min 换算成 60min
20——将吸取0. 5ml反应液换算成IOml
1.9——麦芽糖葡萄糖分子量之比
测得提取液酶活力15064U/g，折算到麸皮中含量60256U/g麸皮。
利用以上方法，实施例1-3的数据列表如下
权利要求
1.一种液态β-淀粉酶制剂的制备方法，其特征在于以麸皮为原料，其工艺步骤包括 麸皮的浸提、固液分离、浸提液的精滤、超滤浓缩、配方、二次精滤、酶活力调整，分述如下浸提(1)配制浸提水在水中按重量/体积比加入防腐剂对羟基苯甲酸乙酯0.01 0. 03%、山梨酸钾0. 1 0. 25%、苯甲酸钠0. 2 0. 5%，还原剂焦亚硫酸钠0. 5 1. 5%、 低亚硫酸钠0. 5 1. 5% ；(2)浸提将麸皮按重量/体积比1 4 7加入步骤(1)配制的浸提水；常压下，浸 提温度控制在40 55°C，pH控制在4. 5 6. 5，浸提6 8小时；固液分离浸提后进行固液分离；精滤分离出的浸提液迅速冷到20°C以下，分离出的浸提液加入1 2%重量/体积比 的硅藻土，过精滤板框进行精滤；超滤浓缩所得精滤液进行超滤浓缩，超滤浓缩的温度控制在20°C以下；配方超滤浓缩到所需规格的酶活力要求后，将所得超滤浓缩液放入配方罐，按重量/ 体积比加入稳定剂18 22 %的氯化钠、8 10 %的醋酸钠、5 8 %麦芽糊精、0. 1 0. 25 % 的山梨酸钾、0. 2 0. 5%苯甲酸钠，搅拌溶解，混合均勻；二次精滤所得配方液中加入1 2%重量/体积比的硅藻土，在20°C以下过精滤板框 进行精滤；酶活力调整收集二次精滤的滤液，取样作成品检验，用稀释液将二次精滤滤液的酶活 力调整到 300000U/g 或 600000U/g。
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征是所述超滤浓缩采用卷式膜，截流分子量为 10 60K道尔顿。
3.根据权利要求
1所述的方法，其特征是所述酶活力调整所用的稀释液是按重量/体 积比加入稳定剂18 22%的氯化钠、8 10%的醋酸钠、5 8%麦芽糊精、0. 1 0. 25% 的山梨酸钾、0. 2 0. 5%苯甲酸钠的水溶液。
专利摘要
本发明涉及一种液态β-淀粉酶制剂的制备方法，其特征在于以麸皮为原料，其工艺步骤包括麸皮的浸提、固液分离、浸提液的精滤、超滤浓缩、配方、二次精滤、酶活力调整。本发明采用合适配比的防腐剂以及合适的温度和pH，能够有效的抑制细菌生长，防止腐败以及酶的失活；所得的产品杂质含量低，相对于固体酶制剂而言所含的工业盐浓度低，易达到食品添加剂标准的要求。本发明是全新的液态β-淀粉酶制剂制备工艺，工艺简单、生产效率高、生产成本低，适合于工业化生产。
文档编号C12N9/26GKCN101323849 B发布类型授权 专利申请号CN 200810023194
公开日2011年6月29日 申请日期2008年7月31日
发明者华家荣, 胡洪清 申请人:无锡赛德生物工程有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan