处理生物质以获得目标化学物质的利记博彩app

专利名称：:处理生物质以获得目标化学物质的利记博彩app处理生物质以获得目标化学物质本申请要求享受2005年4月12日的美国临时申请号60/670437的权益。政府斥又力声明本发明是在美国政府支持下，根据能源部授予的契约号04-34)公开了一系列使用化学计量的氬氧化钠和氨水预处理生物质，其中生物质浓度极低。溶液与生物质的比例是14:1。Elshafei，A.等人(BioresourceTech.(1991)35:73物质得到糖类，其随:被用、作微生物生长的碳源，所述微生物可以制备作为其代谢产物的目标化学物质。通过以较高浓度，使用相对于生物质干重较低浓度的氨预处理生物质来释放糖类。然后使用糖化酶聚生体消化经过氨处理的生物质以生产可发酵糖类。糖类用作能产生目标化学物质的微生物或生物催化剂生长的发酵基质。定义本说明书中使用一些术语。提供了下列定义术语"可发酵糖"是指发酵过程中可以被微生物用作碳源的寡糖和单糖。术语"木质纤维素"是指包括木质素和纤維素的组合物。木质纤维素物质还可以包括半纤维素。术语"纤维素"是指包括纤维素的组合物。生物质"干重"是除去全部或基本上全部水的生物质的重量。通常才艮氺居美国溯'K式和才才泮+学会(AmericanSocietyforTestingandMaterials)(ASTM)标准E1756放氨的化合物例如尿素及其组合物。用于本方法的最小氨浓度足以维持生物质-氨水混合物的碱性pH值，并且最大浓度小于生物质千重的约12wt。/。。这种低浓度的氨足以用于预处理，并且低浓度还可以小于生物质千重的约10wt。/Q。还可以^使用极低浓度的占生物质千重的6%或更少的氨进行预处理。碱性的意思是指pH值大于7.0。特别合适的生物质-氨水混合物的pH值大于8。在一个实施例中，存在的氨小于生物质干重的约10wt。/。。特别合适的氨小于生物质干重的约6wt。/。。用于本方法的氨与其它;威相比具有优势。氨分配到液相和气相中。气态氨比液态^威更容易地扩散穿过生物质，在较低浓度下更有效地进4亍预处理。本文实施例ll还显示氨通过氨解作用，与生物质中的乙酰基酯水解竟争以形成乙酰胺。乙酰胺对某些发酵生物体的毒性比醋酸盐更低，例如运动发酵单胞菌(如本文实施例12所示)。因此，乙酰基酯转化为乙酰胺而不是乙酸，减少了除去乙酸的需求。使用氨还减少了发酵期间用氮源补充生长培养基的需求。此外，氨是一种廉价的原料并且因此提供经济的方法。在预处理期间或预处理之后，氨还可以被循环至预处理反应器，因此实现了更经济的方法。例如，当温度降低至适于糖化时，在预处理之后释放氨气，并且任选地在真空的情况下可以循环氨气。在连续方法中，可以连续循环氨。才艮据本方法，含氨的水溶液任选地包括至少一种其他v喊，例如氢氧化钠、；友酸钠、氢氧化钾、》友酸钾、氢氧化钙和^友酸钙。所述至少一种其他碱的添加量与铵合并的总碱量小于生物质干重的约20wt%。优选第二碱和氨的总量小于约lSwt。/。。例如，可以使用其他碱中和生物质中的酸，来为糖化酶提供金属离子或为发酵生长培养基提供金属离子。在本方法中，生物质干重的初始含量为生物质-氨水混合物重量的至少约15%~约80%。更合适地，生物质干重的含量为生物质-氨水混合物重量的约15%~约60%。生物质占生物质-氨水混合物的百分比维持在较高水平，以使对糖类浓缩的需求最小化，所述糖类得自用于发酵的经过预处理的生物质的糖化。高生物质含量还降低预处理原料的总体积，Y吏该方法更经济。生物质可以以得到的形式直接使用，或可以向生物质施加能量以减少尺寸、增加暴露的表面积和/或使生物质中存在的纤维素、半纤维素和/或寡糖被氨和所述方法第二步所用糖化酶利用的程度。用于减少尺寸、增加暴露的表面积和/或使生物质中存在的纤维素、半纤维素和/或寡糖被氨和糖化酶利用的程度的能量方式包括但不限于，磨细、压碎、磨碎、撕碎、切碎、圓盘精炼、超声和微波。可以在预处理之前或期间、糖化之前或期间或其任意组合中施加能量。在合适的容器中用氨溶液预处理生物质。通常，容器可以经受压力，具有加热机构，并且具有混合内容物的机构。市场上可买到的容器包括例如，Zipperclave⑧反应器(AutoclaveEngineers,Erie,PA)、Jaygo反应器(JaygoManufacturing,Inc.，Mahwah,NJ)和蒸汽枪反应器(GeneralMethods;AutoclaveEngineers,Erie,PA描述)。可以4吏用许多具有相同性能的较大规模的反应器。或者，可以在一种容器中混合生物质和氨溶液，然后转入另一种反应器。还可以在一种容器中预处理生物质，然后在另一种反应器，例如蒸汽枪反应器(GeneralMethods;AutoclaveEngineers,Erie,PA描述)中进一步力口工。在生物质与含氨的水溶液接触之前，向装有生物质的容器施加真空。通过抽空生物质孔隙中的空气，可以使氨更好地渗透入生物质。施加真空的时期和施加于生物质的负压值取决于生物质种类，并且可以凭经验确定以便最理想地预处理生物质(如通过在糖化之后生产可发酵的糖而测量的)。在约4。C~约20(TC温度下使生物质与含氨的水溶液接触。发现生物质与氨在4。C首次接触，允许在该温度下渗透，增加了未经预处理的天然生物质的糖化效率。在另一个实施例中，所述生物质的接触在约75°C~约15(TC下进行。在另一个实施例中，所述生物质的接触在大于90。C至约15(TC下进行。4吏生物质与含氨的水溶液4妄触最多约25小时。预处理时间可以更长，然而由于经济的原因实际上优选较短的处理时间。通常，与氨4^触处理的时间为约8小时或更少。较长时间的优点是降低对施加能量破碎生物质的需求，因此优选最多约25小时的时间。在一个实施例中，在较高温度进行预处理步骤持续较短时间，例如在约10CrC约15(TC进行约5分钟-约2小时。在另一个实施例中，在较低温度进行预处理步骤持续较长时间，例如在约75。C~约100。C进行约2小时约8小时。在另一个实施例中，在室温下(约2226。C)进行预处理步骤持续甚至更长时间，约24小时。还可以使用在这些之间的温度和时间的组合。对于预处理方法，与温度、预处理时间、氨浓度、一种或多种其他碱的浓度、生物质浓度、生物质类型和生物质粒径相关联；因此可以根据需要调节这些变量，以获得最佳的产物与糖化酶聚生体的接触。可以在预处理步骤(即步骤(a))中添加增塑剂、软化剂、或其组合，例如多元醇(例如甘油、乙二醇)、多元醇的酯(例如单乙酸甘油酯)、乙二醇醚(例如二甘醇)、乙酰胺、乙醇和乙醇胺。增塑剂可以作为氨水溶液的组分、单独的溶液或干燥组分^t添加。可以在任何合适的容器中进行预处理反应，例如在间歇式反应器或连续式反应器中进行。本领域技术人员应该认识到在较高温度(高于IOO。C)下需要耐压容器。合适的容器可以装备有用于搅拌生物质-氨水混合物的叶轮等设备。Lm，K.氨。去除氨降低了pH值，并且因此减少了为了获得糖化和发酵所需pH值所用的中和酸。这导致预处理混合物中更低的盐负荷。通常残留某些所需的氨而为发酵提供了氮源。然后，糖化酶聚生体存在下预处理混合物进一步水解，释放水解产物中的寡糖和/或单糖。Lynd,L.R.，etal.(Microbiol.Mol.Biol.Rev.(2002)66:506纤维二糖水解酶、p-葡糖苷酶)、半纤维素水解糖苷酶(例如木聚糖酶、木聚糖内切酶、外切木聚糖酶、P-木糖苷酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖苷酸酶)和淀粉水解糖苷酶(例如淀粉酶、(X-淀粉酶、P-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、(X-葡糖苦酶、异淀粉酶)。此外，向糖化酶聚生体中添加其它活性物质例如肽酶(EC3.4.x.y)、月旨肪酶(EC3.1.1.x禾口3.1.4.x)、木质酶(ECl.ll.l.x)矛口P可魏酰酯酶(EC3.1.1.73)有助于从生物质的其它组分释放多糖。本领域众所周知，产生多糖水解酶的微生物经常显示一种被具有不同底物特异性的若干酶或一组酶催化的活性，例如纤维素降解。因此，得自微生物的"纤维素酶"包括一组酶，这些酶均有助于纤维素降解活性。取决于用于获得酶的纯化方案，商品或非商品酶制剂包括许多酶，例如纤维素酶。因此，本方法的糖化酶聚生体具有酶活性，例如"纤维素酶"，然而应i人识到该活性可以一皮一种以上的酶催^f匕。可以购买糖化酶，例如Spezyme⑧CP纤维素酶(GenencorInternational,Rochester,NY)和Multifect⑧木fHt酶(Genencor)。》匕外，可以以生物学方式，包括利用重组微生物生产糖化酶。本领域:技术人员应该知晓如何确定聚生体中所用酶的有效量并调节获得最佳酶活性的条件。本领域技术人员还应知晓如何优化聚生体内所需酶活性的种类，以在选定条件下使给定的预处理产物获得最佳的糖化。优选糖化反应在对于糖化酶最佳的温度和pH值或其附近进行。在本方法中糖化酶聚生体的最适温度为约15。C~约100。C。在另一个实施例中，最适温度为约2(TC~约80。C。最佳pH值为约2约11。在另一个实施例中，本方法中糖化酶聚生体的最佳pH值为约4~约10。糖化可以进行约几分钟~约120小时，并且优选约几分钟~约48小时。反应时间取决于酶浓度和比活度以及所用底物和环境条件，例如温度和pH值。本领域技术人员可以容易地确定特定底物和糖化酶聚生体所用的最佳温度、pH值和时间。糖化可以分批进4亍或连续进行。糖化还可以一步完成或在若千步中完成。例如，糖化所需的不同酶具有不同的最适pH值或最适温度。可以在一个温度和pH值用酶进行初步处理，然后在不同温度和/或pH值用不同的酶进行二次处理或三次(或更多)处理。此外，可以在相同的pH值和/或温度或不同的pH值和温度，用不同的酶在顺序步骤中进行处理，例如使用在较高的pH值和温度下稳定的并更具活性的半纤维素酶，继之以在较低pH值和温度下具有活性的纤维素酶。可以通过测量单糖和寡糖的释放来监控在糖化之后得自生物质的糖类的溶解度。测量单糖和寡糖的方法为大家所熟知。例如，使用1,3甲烷、乙烯、丙酮和工业酶。可以使用一种或多种合适的生物催化剂通过单级或多级发酵将糖类发酵为目标化学物质。生物催化剂可以是选自细菌、丝状真菌和酵母的微生物。生物催化剂可以是野生型微生物或重组的微生物，并且包括埃希氏菌属、发酵单胞菌属、酿酒酵母属、念珠菌属、毕赤氏酵母属、链霉菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属和梭状芽胞杆菌属。在另一个实施例中，生物催化剂可以选自重组的大肠杆菌、运动发酵单胞菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、酿酒酵母、热纤梭菌、解糖热厌氧杆菌和树干毕赤酵母。已经描述了许多用于发酵生产目标化学物质的生物催化剂，并且通过突变方法生产的或通过重组方法工程化的其它生物催化剂。任何利用在本方法中生产的可发酵糖的生物催化剂可以被用于通过在本方法通过发酵制备目标化学物质。已知生溶剂的冲炎状芽孢杆菌(JonesandWoods(1986)Microbiol.Rev.50:484(2003)Appl.Environ.Microbiol.69:399-407)，杆菌属的天然菌抹(US20050250192)和米才艮霉(TayandYang(2002)Biotechnol.Bioeng.80:1—12)在发酵中生产乳酸。大肠杆菌的重组菌抹已经被用作发酵的生物催化剂来生产1,3丙二醇(US6013494,US6514733)和己二酸(Niuetal.,(2002)Biotechnol.Prog.18:201-211)。使用重组的梭状芽孢杆菌(Cheryanetal.，(1997)Adv.Appl.Microbiol.43:1菌空变型生产苏氨酸。百合棒杆菌空变型生产甲硫氨酸(Kumaretal，(2005)Bioresour.Technol.96:287。C。在预处理结束时，通过排气冷凝器降低反应器压力，并且打开反应器并在回收经过预处理的生物质之前施加真空(约85kPa)3分钟以降温并从经过预处理的浆液除去多余的氨。将含有0.5g纤维素(基于最初的原料组成)的完整的、未洗涤的预处理浆液添加入最终容积为50mL~125mL的摇并瓦。由于酶对高pH值环境敏感，在添加酶之前加入乙酸(10-100^L)而将经过氨预处理的生物质的pH值滴定至5.0。糖化期间通过添加50mM柠檬酸緩冲液将pH值控制在5.0，并且将温度维持在50。C。按表l对每份样品列出的浓度添加Spezyme⑧CP纤维素酶(GenencorInternational,Rochester,NY)。if唐4ti96小时后，根据一般方法中描述的糖类测量方案测定所得糖化液的糖含量。表2显示96小时之后释放的糖类。本实验的对照是l)未经处理的玉米秸杆，其葡萄糖的理论产量为23。/。(使用56mg纤維素酶/g纤维素)和2)蒸汽U40。C)预处理的玉米秸杆，其葡萄糖的理论产量为40%(使用56mg纤维素酶/g纤维素)；对照不测量木糖。表1:糖化96小时后经过预处理的玉米秸杆释放的糖类DWB:生物质干重<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>这些结果显示使用12%的氨在140°(3预处理15分钟，然后糖化，比使用35。/。的氨在14(TC预处理5分钟释放更多的葡萄糖和木糖。因此，少量增加预处理时间可以体现使用较低浓度氨的优势。实施例2在高生物质浓度、低温和极低浓度氨情况下秸杆的预处理Jaygo反应器装有O.635-cm磨碎的秸杆(干重Ukg)。向容器施加真空(67.7kPa),并注入稀释的氨水溶液以使氨浓度为6.2g氨/100g生物质干重并且生物质含量的千重为生物质-氨水混合物总重量的30wt%。解除真空，向夹套施加蒸汽以加热秸杆至100。C。将浸透的秸杆在该温度保持8小时，在32rpm下恒速搅拌，然后持续混合所得浆液以冷却过4艾。将含有0.5g纤维素(基于最初的原料组成)的完整的、未洗涤的预处理浆液添加到最终容积50mL~125mL的摇瓶中。由于酶对高pH值环境敏感，必要时在添加酶之前加入乙酸(10实施例4在高生物质浓度、高温和极低氨浓度条件下预处理玉米棒子，然后进行高生物质浓度糖化将折断的玉米棒子(干重13kg)装入Jaygo反应器。对反应器施加真空之后，向反应器注入适当浓度的氨水溶液以产生2%氨和30%生物质浓度的干重，在室温下以32rpm搅拌。然后使用低压夹套蒸汽加热反应器内容物至95。C。一旦反应器达到95。C,使用直接蒸汽注入加热反应器内容物至145'C。当反应器达到145°(3,使用夹套蒸汽和一定的直接蒸汽注入将反应器内容物在该温度维持20分钟。在20分钟之后，从通风孔向反应器施加真空并开启切碎机马达5分钟。l小时之后，开启通向夹套的冷却水。将Jaygo反应器的内容物冷却至33'C~37°C;然后使用002将反应器增压至138kPa。增压C02气压维持30min。反应器内容物的最终温度为27'C~31°C。浸透的/经过预处理的生物质的pH值为约7.5。始时，生物质浓度的最终千重为经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混合物总重量的30%。然后用固体柠檬酸调节pH值至5.5,并如实施例3所述用在未经处理的玉米棒子中的28mgSpezymeCP⑧/g纤维素和28mg1^必^"乂^&1^6@/8纤维素消化原料。根据一般方法中的糖类测量方案测定所得糖化液的糖含量。表4显示在消化96小时之后释放的糖类。表4:在糖化期间使用高浓度生物质(干重)，从经过预处理的玉米棒子释放的糖类。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>实施例5添加增塑剂进行预处理如实施例3所述预处理完整的玉米棒子，生物质浓度的干重为生物质-氨水混合物总重量的约30%,氨为生物质干重的2wt%，在IO(TC下在Jaygo反应器进4于8小时，添加占生物质干重3wt。/o的甘油作为增塑剂。在预处理之后，用固体柠檬酸将所得物质的pH值调节至5。然后如实施例3中所述消化经过预处理的玉米才奉子。使用28mgSpezymeCP/g纤维素在未经处理的秸杆中加28mg/g纤维素MultifectXylanase在未经处理的玉米棒子中的酶混合物。在消化96小时之后，葡萄糖浓度为92.3g/L并且木糖浓度为54.4g/L。实施例6对经过预处理的生物质进行圆盘精炼如实施例l所述对秸杆进行预处理，不同样品使用低氨浓度(12%)或对照氨浓度(35%),并且温度、时间和酶条件如表5中所列。如实施例3所述对完整的玉米棒子进行预处理，不同样品使用极低氨浓度(3%或6%),并且其它条件如表5中所列。在预处理之后，让样品经过SproutWaldron圆盘磨。将固定平板和旋转平板之间的间隙设为0.254mm(0.010英寸)并且输送螺旋速度为7rpra。如实施例2中所述糖化经过精炼的原料，并且根据一般方法中的糖类测量方案测定所得糖化液的糖含量。表5中显示糖化96小时的结果。结果显示在糖化之前进行圓盘精炼，可以更好地消化，或使用较低浓度的酶是有效的。表5:在糖化之前进行圓盘精炼的经过预处理的原料的可消化性<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>实施例7经过预处理的生物质的蒸汽枪处理如实施例l中所述预处理秸杆，所用条件为生物质千重占生物质-氨水混合物总重量的30%、占DWB6wt。/o的氨、100°C、8小时、Jaygo反应器。如实施例3中所述预处理玉米棒子，所用条件为生物质干重是生物质_氨水混合物总重量的40%、占DWB6wt。/。的氨、93。C、8小时、Jaygo反应器。将每份经过预处理的生物质样品单独装入4升的蒸汽枪反应器。在经过冲模释放之前，使经过预处理的原料经受170。C5分钟或140。C20分钟。如实施例2中所述糖化所得原料。结果显示于下面的表6中。结果显示在糖化之前进行蒸汽枪处理改善了葡萄糖的释放c表6:在蒸汽枪处理之后经过预处理的原料的可消化性<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>实施例8使用氨循环的预处理模型对于下列两种预处理方案，4吏用Aspen才莫型(AspenTechnologies,Cambridge,MA，version12.1);险查氨循环的优点低温(85°C)长保留时间(4小时)和高温(lWC)短保留时间(20分钟)。在每种模型中存在一系列三个闪蒸箱，在预处理反应器之后，以连续较低的压力操作以提供氨循环手段。当原料流进入每个闪蒸箱时，其由于压力减少而分为蒸气和液体部分。蒸气部分循环至预处理，而液体部分继续4于进到下一步。假设预处理中氨占DWB的2wt乂并且生物质干重为生物质-氨水混合物总重量的约27%，表7中显示每一步新鲜供应的氨和循环液流供应的氨。在两种模型中，闪蒸箱以相似的方式运转以便氨循环相似。对于两种方案，所需氨的一半以上由循环供应，降低了对新鲜氨的需求和成本。表7:在预处理中的氨循环-Aspen模型试验结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>实施例9从低浓度氨预处理和糖化的玉米棒子生物质生产乙醇以及与高浓度氨预处理和糖化的秸杆对比如实施例3中所述，通过在Jaygo反应器中于93。C预处理完整的玉米棒子8小时生产玉米棒子水解产物，所用氨浓度占生物质干重的6wt。/。，生物质浓度的干重占生物质-氨水混合物总重量的40城％。在预处理之后，在真空下加热反应器至9(TC以除去氨。然后用硫酸调节经过预处理的生物质的pH值至5。在Jaygo反应器中糖化经过预处理的生物质，生物质干重占经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混合物总重量的30%，使用28mg/g纤维素Spezyme⑧纤维素酶和28mg/g纤维素Multifect⑧木聚糖酶，于50。C和pH5下糖化168小时。所得水解产物用于在Sixfors发酵罐(INFORSAG，Switzerland)中运动发酵单胞菌8b的发酵。运动发酵单胞菌8b是一抹已经进行遗传工程化的运动发酵单胞菌，其具有比野生型改善的乙醇生产并被描述在美国专利申请公开号2003/0162271Al(实施例IV、Vl和XII)中。玉米棒子水解产物含有78g/L葡萄糖、51g/L木糖、6g/L乙酰胺和7g/L乙酸。使用40%和80%浓度的玉米棒子水解产物，与其平衡的培养基是浓缩的液体培养基，液体培养基由酵母提取物和KH2P04，其含量使其在最终浆液中的浓度分别为约5g/L和2g/L。此外，在40%水解产物浆液中，添加萄萄糖和木糖使其浓度足以与80%水解产物浆液中的浓度相同。发酵在37。C下进行。发酵罐中的搅拌为100rpm，并且通过添加2NKOH维持pH值5.5。在表8中显示了结果。如一般方法中所述分析糖类和乙醇。为了进行比较，如实施例l中所述，在Zipperclave⑧反应器中，于170。C预处理秸杆5分钟产生秸杆水解产物，所用氨的浓度为生物质干重的35wt%,生物质浓度的干重为生物质-氨水混合物总重量的约30wty。。对经过预处理的生物质进4于酶消化，生物质干重为经过予贞处理的生物质-糖化酶聚生体混合物总重量的30%,使用224mg/g纤维素SpezymeCP纤维素酶于50°C和pH5下进行，以产生用于发酵试验的高糖含量的水解产物。所得水解产物包括88g/L葡萄糖、52g/L木糖、9g/L乙酸和15g/L乳酸。为了生产乙醇，对40%或80%(v/v)水解产物浆液进行运动发酵单胞菌8b的发酵。剩余体积由浓缩液体培养基组成，该培养基由酵母提取物、KH2P04和MES緩冲液组成，其含量使其在最终浆液中的浓度分别为约10g/L、2g/L和0.1M。此外，在40%水解产物浆液中，添加定量的葡萄糖和木糖，使其浓度足以与在80%水解产物浆液中的浓度相同。于30。C和pH6下在具有20ml工作容积的25ml摇瓶中进行发酵。在150rpm下维持搅拌。分析玉米棒子水解产物发酵样品并且结果列于表8中。表8:在针对玉米棒子和秸杆水解产物的发酵中糖的利用和乙醇产量<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>这些结果显示，用从经过低浓度氨预处理的玉米棒子水解产物的发酵生产乙醇比用经过高浓度氨预处理的秸杆的效率更高。实施例IO从经过极低浓度氨预处理和糖化的玉米棒子生物质生产1,3丙二醇将经过预处理和糖化的玉米棒子产生的水解产物发酵以生产1，3-丙二醇。在蒸汽枪反应器中预处理玉米棒子碎片以产生水解产物。首先将玉米棒子生物质装入PEHR(—般方法描述)，施加真空，并注入稀释的氨水溶液以使氨浓度为4g氨/100g生物质千重，生物质浓度的千重为30g生物质干重/100g总生物质-氨水混合物。将装有氨和玉米棒子的反应器容器于4X:旋转30分钟。将内容物转入蒸汽枪反应器(一般方法所述)，温度升高至14VC,并且将混合物维持在该温度20分钟。蒸汽枪中的物质进入闪蒸箱，维持闪蒸箱真空以帮助除去氨。在调节pH值之后，将经过预处理的生物质以30g生物质干重/100g经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混合物糖化，使用28.4mg/g纤维素Spezyme0@纤维素酶和IO.Img活性蛋白质/g纤维素酶聚生体(包括p-葡糖苦酶、木聚糖酶、卩-木糖苦酶和阿拉伯呋喃糖酶)，于5(TC和pH5.5下糖化72小时。所得水解产物被用作可发酵糖的来源，用于通过重组的大肠杆菌菌抹RJ8npBE93的产物包括甘油(中间代谢物)和1,3-丙二醇。实验在烧瓶中平行进刊-两次并在24小时时分析。在该体系中，水解产物中的葡萄糖转化为甘油和1,3-丙二醇。表9:通过采用大肠杆菌发酵的底物利用和产物形成时间为零时的液体培养基烧瓶1,24小时烧瓶2,24小时葡萄糖(g/L)7.392.122.10甘油(g/L)03.143.141，3—丙二醇(g/L)01.031.07葡萄糖的利用率071%72%实施例ll在预处理期间乙酰胺的形成分析经过实施例3和实施例4所述方法预处理的玉米才奉子4f品，以确定生物质中乙酰基的走向。如下分析预处理液(除去不溶性固形物的预处理混合物)的乙酸和乙酰胺含量。用H2S04(72%)调节每份样品的pH值至约3。对于乙酰胺的测量，让样品通过0.2)im过滤器并根据下列条件通过HPLC进行分析。对于总乙酸盐(包括以乙酸和乙酰胺形式存在的乙酸盐)的测量，将酸化样品于12rC高压灭菌l小时；在该步骤期间乙酰胺定量转化为乙酸。在高压灭菌之后，冷却样品。然后使样品通过0.2pm过滤器进入样品小瓶并根据下列条件进行分析。根据各自产生的标准曲线测定乙酸和乙酰胺的浓度。流动相0.01NH2SO4,0.2jxm过滤并脱气的流速0.6mL/mm柱温55~65°C检测器温度尽可能接近柱温检测器折射率运4亍时间60分钟柱具有相应保护柱的BioradAminexHPX表l0:在预处理期间生物质中的乙酰胺向乙酰基的转化。DWB,生物质的干重(相对于生物质-氨水混合物的总重量计算百分比)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>使用6%浓度的氨，几乎一半乙酰基转化为乙酰胺，其如实施例12所示对生物催化剂生长无抑制性。实施例12乙酰胺和乙酸对单胞发酵菌生长的影响为了测试乙酰胺和乙酸的毒性，于pH值6.0，在有和没有乙酰胺或乙酸条件下，在发酵培养基中培养运动发酵单胞菌菌抹8b(实施例9描述)。发酵培养基由10g/L酵母提取物、2g/LKH2P04、70g/L葡萄糖、40g/L木糖和0.1MMES緩冲液组成。将运动发酵单胞菌8b在25在高生物质浓度、高溫和极低氨浓度条件下预处理甘蔗渣，并且以低和高浓度进行糖化给不具有研磨介质的PEHR(常规方法中描述)中装入1.27cm磨碎的甘蔗渣(干重370g)。这些甘蔗渣是NIST参照物质RM8491,来自甘蔗纯系H65ND:未确定结果显示，与未经过预处理的对照相比，使用极低氨浓度预处理甘蔗渣允许相当多的糖释放，而在PEHR中以高千生物质浓度糖化在释放糖类方面非常有效。实施例M在高生物质浓度、高温和极低氨浓度条件下预处理美国鵝掌楸锯屑，并且以低和高浓度进4亍糖化在不具有研磨介质的PEHR中装入美国鵝掌楸锯屑(干重596g;购自SawmillerInc.，Haydenville,OH)。向反应器容器施加真空，并注入稀释的氨水溶液以使氨浓度为6g/100g生物质干重，并且生物质浓度的干重为44g/100g总生物质-氨水混合物。如实施例13中所述，将装有氨和美国鵝掌楸锯屑的反应器容器置于4。C,并于4。C旋转30分钟。这时，将内容物转入蒸汽枪反应器。一旦蒸汽枪反应器装入了氨-美国鹅掌楸混合物，温度升至145。C并且在该温度维持混合物20分钟。在预处理结束时，通过l英寸圆型冲模从蒸汽枪反应器排出美国鹅掌楸锯屑，进入闪蒸箱。随后，将经过预处理的美国鵝掌楸锯屑样品如实施例13中所述在摇瓶中糖化，并且将另一个样品在PEHR中糖化。以占经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混合物总重量5%的生物质干重进行摇瓶糖化，而以占经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混合物总重量30%的生物质干重进行PEHR糖化(使用干重约279g的经过预处理的锯屑)。将未经预处理的美国鵝掌楸锯屑也以占经过预处理的生物质-糖化酶聚生体混合物总重量5%的生物质干重在摇瓶中糖化。所有糖化均使用28.4mg/g纤维素SpezymeCP⑧纤维素酶和28.4mg/g纤維素Multifect木聚糖酶于50。C和pH值5.5进行96小时。下表12中给出的产量是作为理论产量百分比的每种糖类的释放量。表12:在美国鹅掌楸锯屑的预处理和糖化之后的产量成分未预处理5%DWB糖化预处理5%DWB糖化预处理30%DWB糖化<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>ND:未确定结果显示，与未经预处理的对照相比，用极低氨浓度预处理的美国鹅掌楸锯屑允许相当量的糖类释放，而在PEHR中以高生物质干重进行糖化对纟奪i文糖类比摇弁瓦更有效。实施例15通过对得自极低氨浓度预处理和糖化的玉米棒子生物盾的水解产物进行酵母发酵来生产乙醇与实施例10相同的用于生产1,3-丙二醇的水解产物也用于通过酵母发酵生产乙醇。这些水解产物被用作在摇瓶中通过野生型酿酒酵母发酵糖来源转化为乙醇。以10%(v/v)浓度使用该水解产物，与其平衡的液体培养基包括IOg/L酵母提取物和20g/L蛋白胨。在装有50mL培养基的250mL挡板烧^f瓦中培养酵母。将培养物于30。C以250rpm振摇培养24小时。如实施例9中所述通过HPLC测量产生的乙醇量，下表13中列出了两份烧瓶的结果。表13:通过用酵母发酵的底物利用和产物形成。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>实施例16通过从得自极低氨浓度预处理和糖化的玉米棒子生物质的水解产物进行乳酸杆菌发酵来生产乳酸与实施例10相同的用于生产1,3-丙二醇的水解产物也用于在摇瓶中发酵短乳杆菌来生产乳酸。以10%(v/v)的浓度使用水解产物，与其平衡的液体培养基包括5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、2g/L柠檬酸铵、5g/L乙酸钠、0.1g/LMgS04、0.05g/LMnS04和2g/LK2HP04以及1g/L吐温。在装有50mL肉汤的250mL挡板烧瓶中培养乳酸杆菌。于34。C以150rpm振荡培养24小时，重复培养。如实施例10中所述通过HPLC测量产生的乳酸量并列于表M中。两个烧瓶的2份样品是同样培养的重复试验。表14:通过用短乳杆菌发酵的底物利用和产i的形成<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>实施例17以较高的干生物质浓度，用极低氨浓度预处理玉米棒子用颚间距约0.95cm的颚式破碎机(2.2kW马达)处理完整的玉米才奉子，继之以石皮块才几(1.5kW马达，FranklmMillerInc.，Livingston,NJ),然后用装备有1.9cm美国标准筛的Sweco筛筛选。将约805g折断的玉米棒子装入PEHR。玉米棒子的水分含量为约7%。在装料之前用氮气冲洗反应器容器中的空气5次。在实验开始前，将不具有研磨介质的反应器预热至75r,不旋转。当反应器容器内温度稳定在75。C时，开启保温箱内的旋转机构并调节转速到19rpm。然后向反应器注入合适量的稀释的氨水溶液以使氨浓度为6g氨/100g生物质干重，并且固形物浓度为50g生物质干重/100g生物质-氨混合物总重量。还向溶液添加lg/100g生物质干重的乙醇。将氨溶液泵过加热至75。C的水浴中的使用2加仑的Parr反应器制造的加热环。通过注入喷管向反应器容器中注入加热的稀释的氨水溶液，并在反应器中喷涂旋转并滚动的折断的玉米棒子。将反应器维持在75。C持续2小时，同时以19卬m旋转。结束时，向反应器容器施加真空(约85kPa)30分钟以除去氨，并将反应器内容物的温度降至约50。C。然后将二氧化碳注入反应器以解除真空，并用C02将反应器加压至103kPa表压并于该压力在50。C维持30分钟。之后，将反应器卸压，打开并添加研磨介质。4吏用注入喷管注入pH值为4.8的1M柠檬酸緩冲液并添加柠檬酸一水化物，以增加柠檬酸緩冲液浓度至75mM,将内容物的pH值调节至约5.5。并非所有氨均在真空步骤中被除去，也没有被C02中和。在加热至50。C之后，将柠檬酸緩冲液注入反应器，然后将反应器于50。C和19rpm保温l小时以使内容物平衡。在使用注入喷管注入柠檬酸緩冲液的同时，旋转反应器使得緩冲液更均匀地喷洒并分布在经过预处理的玉米棒子颗粒上。从保温箱取出反应器，打开，测定样品的pH值。如果pH值大于5.5,那么额外添加固体柠檬酸一水化物，并将反应器于搅拌下在50。C再保温一小时。重复这些步骤直至pH值为约5.5。一旦达到所需的pH值，将12.9mg/g纤维素SpezymeCP(Genencor)和5mg活性蛋白质/g纤维素酶聚生体(包括(3-葡糖苷酶、木聚糖酶、P-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖酶)装入反应器。将反应器置于保温箱，在5(TC19rpm下持续72小时。在这些预处理和糖化之后，单体葡萄糖的产量是62.0%并且单体木糖的产量是31.0%。总葡萄糖产量是75.2%并且总木糖产量是80.3%。实施例18以较高的固形物浓度，用极低浓度的氨和替换条件预处理玉米棒子用锤磨机(IO英寸锤磨机，GlenMillsInc.,Clifton,NH)处理完整的玉米棒子，使其通过1.27cm筛。将约805g折断的玉米棒子装入PEHR。玉米棒子的水分含量为约7%。向反应器中添加22个陶资磨碎圆筒(直径3.2cmx长3.2厘米；E.R.AdvancedCeramics,EastPalestine,OH)。在实验开始前，将反应器预热至95。C,不旋转。在开始之前，向反应器容器施加真空(约85kPa)并密封容器。当反应器容器内温度稳定在95。C时，开启保温箱内的旋转机构并调节转速到19rpm。然后向反应器内注入合适量的稀释的氨水溶液以使氨浓度为6g氨/100g生物质干重，并且固形物含量为50g生物质干重/100g生物质-氨混合物总重量。将氨溶液泵过在沸水浴中的使用2加仑Parr反应器制成的加热环。通过注入喷管向反应器容器注入加热的稀释的氨水溶液，并在反应器中喷涂旋转并滚动的折断的玉米棒子。将反应器维持在95。C持续2小时，同时以19rpm转动。在结束时，向反应器容器施加真空(约85kPa)30分钟以除去氨，并将反应器内容物的温度降至约50。C。然后将二氧化碳注入反应器以解除真空，并且将反应器加压至103kPa表压并于该压力在50。C维持30分钟。之后，降低反应器压力，打开，并注入pH值为4.8的添加并溶有柠檬酸一水化物的1M柠檬酸緩冲液，将内容物的pH值调节至约5.5。在加热至5(TC之后，将柠檬酸缓冲液注入反应器，然后将反应器于50。C和19rpm保温1小时以使内容物平衡。在使用注入喷管注入柠檬酸緩冲液的同时，旋转反应器，使得緩冲液更均匀地喷洒并分布在经过预处理的玉米f奉子颗粒上。从保温箱取出反应器，打开，测定样品的pH值。如果pH值大于5.5,那么额外添加固体柠檬酸一水化物，并将反应器于搅拌下在50。C再保温一小时。重复这些步骤直至pH值为约5.5。一旦达到所需pH值，将12.9mg/g纤维素SpezymeCP(Genencor)和5mg活性蛋白质/g纤维素酶聚生体(包括P-葡糖苷酶、木聚糖酶、p-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖酶)装入反应器。将反应器置于保温箱，在50。C和19rpm下持续72小时。在这些预处理和糖化之后，单体葡萄糖产量是50.7%并且单体木糖产量是35.7%。总葡萄糖产量和总木糖产量分别是71.7%和89.8%。实施例19用极低浓度的氨和额外的碱预处理玉米棒子用颚间距为约0.95cm的颚式破碎机(2.2kW马达)处理完整的玉米棒子，继之以破块机(1.5kW马达，FranklinMillerInc.)处理,然后用装备有1.9cm美国标准筛的Sweco筛筛选。将约460g折断的玉米^奉子装入PEHR。玉米棒子的水分含量为约7%。在实验开始前，将反应器预热至95°C，不旋转。在开始之前，向反应器容器施加真空(约85kPa)并密封容器。当反应器容器内温度再次稳定在95。C时，开启保温箱内的旋转机构并调节转速到19rpm。然后向反应器注入合适量的氨水溶液以使氨浓度为3.2g氨/100g生物质干重，注入NaOH使得达到1.9gNaOH/100g生物质干重，同时维持固形物含量为30g生物质干重/100g生物质-氨混合物总重量。将氨和额外的碱性溶液泵过在沸水浴中，的使用2加仑Parr反应器制造的加热环。通过注入喷管将加热的稀释的氨水溶液注入反应器容器，并在反应器中喷涂旋转并滚动的折断的玉米棒子。在注入之后，解除容器真空至大气压。将反应器维持在95。C持续30分钟，然后将温度降低至85。C并维持4小时。在结束时，向反应器容器施加真空(约85kPa)30分钟以除去氨，并将反应器内容物的溫度降至约50。C。然后将二氧化碳注入反应器以解除真空，并且将反应器加压至103kPa表压并在该压力于WC下维持30分钟。之后，降低反应器压力，打开，并注入约75mlpH值为4.8的添加并溶有柠檬酸一水化物的1M柠檬酸緩冲液，将内容物的pH值调节至约5.5。在加热至50。C之后，将柠檬酸緩冲液注入反应器，然后将反应器于50。C和19rpm下保温1小时以使内容物平衡。在使用注入喷管注入柠檬酸緩冲液的同时旋转反应器，使得緩冲液更均匀地喷洒并分布在经过预处理的玉米棒子颗粒上。从保温箱取出反应器，打开，测定样品的pH值。如果pH值大于5.5,那么额外添加固体柠檬酸一水化物，并将反应器于搅拌下在5(TC再保温一小时。重复这些步骤直至pH值为约5.5。一旦达到所需的pH值，将28.4mg/g纤维素SpezymeCP(Genencor)和28.4mg/g纤维素Multifect装入反应器。将反应器置于保温箱，在50X:和19rpm下持续72小时。在这些预处理和糖化之后，单体葡萄糖产量是56.1%并且单体木糖产量是39.5%。总葡萄糖产量和总木糖产量分别是82.8%和84.2%。这些数值是2次实验的平均值。实施例20室温和极低浓度氨预处理用颚间距约3/8英寸的颚式破碎机(2.2kW马达)处理完整的玉米棒子，继之以破块机(1.5kW马达，FranklinMillerInc.)处理，然后用装备有1.9cm美国标准筛的Sweco筛筛选。将约460g折断的玉米棒子装入PEHR。玉米才奉子的水分含量为约7%。还向反应器中添加22个陶瓷磨石争圆筒(直径3.2cmx长3.2厘米；E.R.AdvancedCeramics,EastPalestine,OH)。在开始之前，向反应器容器施加真空(约85kPa)并密封反应器。当反应器内温度再次稳定在室温时(22权利要求1.一种生产来源于生物质的目标化学物质的方法，包括a)使生物质与含氨的水溶液接触，其中氨的浓度至少足以维持生物质-氨水混合物的碱性pH值，但是其中所述氨的存在量小于生物质干重的约12wt％，并且进一步，其中生物质的干重处于占生物质-氨水混合物重量的至少约15wt％的高固形物含量下；b)在适于生产可发酵糖的条件下，使步骤(a)的产物与糖化酶聚生体接触；以及c)在合适的发酵的条件下，使步骤b)的产物与至少一种能发酵糖类以生产目标化学物质的生物催化剂接触。2.权利要求l所述的方法，其中同时进行步骤(b)和(c)。3.权利要求1所述的目标化学物质，选自酸类、醇类、烷烃、烯烃、芳香族化合物、醛类、酮类、生物聚合物、蛋白质、肽、氨基酸、维生素、抗生素和药物。4.权利要求l所述的方法，其中目标化学物质选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、甘油、赤藓醇、木糖醇、山梨糖醇、乙酸、乳酸、丙酸、3-羟基丙酸、丁酸、葡#唐酸、衣康酸、柠檬酸、琥珀酸、乙酰丙酸、谷氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甲烷、乙烯、丙酮和工业酶。5.权利要求4所述的方法，其中目标化学物质是乳酸、丙二醇或乙醇。6.权利要求l所述的方法，其中所述的至少一种生物催化剂选自细菌、丝状真菌和酵母。7.权利要求l所述的方法，其中至少一种生物催化剂选自野生型、空变型或重组的埃希氏菌属、发酵单胞菌属、念珠菌属、酿酒酵母属、毕赤氏酵母属、链霉菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属和梭状芽胞杆菌属。8.权利要求l所述的方法，其中所述至少一种生物催化剂选自重组的大肠杆菌、运动发酵单胞菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、酿酒酵母、热纤梭菌、解糖耐热厌氧杆菌和树干毕赤酵母。9.权利要求l所述的方法，其中生物质-氨水混合物的pH值大于8。10.权利要求l所述的方法，其中在使生物质与含氨的水溶液接触之前，向生物质施加真空。11.权利要求l所述的方法，其中所述生物质干重处于至少约15%~约80%的高固形物含量下。12.权利要求ll所述的方法，其中所述生物质干重处于至少约15%~约60%的高固形物含量下。13.权利要求l所述的方法，其中所述的氨的存在量小于生物质干重的约10wt0/0。14.权利要求13所述的方法，其中所述的氨的存在量为生物质干重的约6%或更小。15.权利要求l所述的方法，其中生物质选自生物能农作物、农业残留物、城市固体废物、工业固体废物、庭院废物、木材和森林废物。16.权利要求l所述的方法，其中生物质选自柳枝稷、废纸、造纸淤泥、玉米颗粒、玉米纟奉子、玉米皮、玉米秸杆、草、小麦、麦杆、干草、大麦、大麦秆、稻草、甘蔗渣、高粱、大豆、从加工谷物得到的组分、树木、树枝、根苗、叶、木材碎片、锯屑、灌木和灌木丛、蔬菜、水果、花和牲畜粪。17.权利要求16所述的方法，其中生物质选自玉米棒子、玉米秸杆、玉米皮、甘蔗渣、锯屑、柳枝稷、麦杆、干草、大麦秆、稻草和草。18.权利要求17所述的方法，其中生物质选自玉米棒子、玉米秸杆、锯屑和甘蔗渣。19.权利要求l所述的方法，其中氨选自氨气、氨水、尿素及其组合。20.权利要求1所述的方法，其中(a)是在约4'C200。C的温度下进行的。21.权利要求20所述的方法，其中(a)是在约75。C~15(TC的温度下进行的。22.权利要求21所述的方法，其中(a)是在大于90。C~15(TC的温度下进行的。23.权利要求l所述的方法，其中最多进行(a)约25小时。24.权利要求23所述的方法，其中最多进行(a)约8小时。25.权利要求1或2所述的方法，其中在(b)之前除去至少一部分(a)中的氨。26.权利要求25所述的方法，其中将来自(a)的氨循环。27.权利要求l所述的方法，其中(b)的接触是在至少约15%的生物质干重浓度下进行的。28.权利要求l所述的方法，其中将(a)、(b)或(a)和(b)重复至少一次。29.权利要求l所述的方法，进一步包括在(a)中添加至少一种增塑剂、软化剂或其组合。30.权利要求29所述的方法，其中所述的至少一种增塑剂、软化剂或其组合选自多元醇、多元醇酯、乙二醇醚、乙酰胺、乙醇和乙醇胺。31.权利要求l所述的方法，进一步包括在(a)之前或期间、在(b)之前或期间或其组合中施加能量。32.权利要求31所述的方法，其中所述能量选自碾磨、压碎、磨碎、扭斤碎、切碎、圆盘精炼、超声和微波。33.权利要求l所述的方法，其中在糖化之前使用来自发酵的二氧化碳来调节预处理混合物的pH值。34.权利要求l所述的方法，其中所述糖化酶聚生体包括至少一种糖苷酶。35.权利要求1所述的方法，其中所述糖化酶聚生体包括至少一种选自纤维素水解糖苷酶、半纤维素水解糖苷酶、淀粉水解糖苦酶、肽酶、脂肪酶、木质酶和阿魏酰酯酶的酶。36.权利要求l所述的方法，其中所述糖化酶聚生体包括至少一种选自纤维素酶、葡聚糖内切酶、外切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、p-葡糖苷酶、木聚糖酶、木聚糖内切酶、外切木聚糖酶、卩-木糖苦酶、阿拉伯木聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖酶、果胶酶、葡糖苦酸酶、淀粉酶、a-淀粉酶、(3-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、a-葡糖苦酶、异淀粉酶的酶。37.权利要求1所述的方法，其中(b)是在约15°C~约100。C的温度下和约2~约11的pH值下进行的。专利摘要使用生物催化剂生产目标化学物质，所述生物催化剂能够发酵来源于生物质的糖类。通过在高固形物和低氨浓度的条件下预处理生物质，继之以糖化而获得了糖类。文档编号C12P1/00GKCN101160405SQ200680012124公开日2008年4月9日申请日期2006年4月12日发明者J·B·邓森,M·特克,R·埃兰德,S·亨尼西申请人:纳幕尔杜邦公司导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan