专利名称:生物试样操作方法
技术领域：
本发明涉及一种对细胞等的生物试样注入或者滴加含有基因、蛋白质或酶等的药液的生物试样操作装置，特别是涉及一种使用了悬臂的生物试样操作装置。
背景技术：
以往，在生物研究、病理研究等的领域中，人们将基因等注入到细胞内部而使其进行表达。这里，作为将基因等注入细胞等生物试样的内部的方法，一直使用的是配备在扫描型探针显微镜中的悬臂的方法(参考专利文献1)。图8是显示现有的生物试样操作装置的一例的图。如图所示，生物试样操作装置80，具备悬臂82和针状物83，其中，悬臂82配置在未图示的扫描型探针显微镜中、并且在端头部突出设置了尖锐形状的探针81 ；针状物83 安装在该悬臂82的端头、由碳纳米管等构成。在使用本生物试样操作装置80时，将基因等固定在针状物83的端头，通过扫描悬臂82将针状物83插入细胞84而使基因等导入细胞 84内，保持在该状态下而使基因得以表达。
另一方面，本申请人曾提出了使用了悬臂的微细加工装置(参考专利文献幻。该微细加工装置具备单端被支持的悬臂部和突出设置在该悬臂部的端头的突出部，在突出部形成了空洞，并且形成了从该空洞通向突出部外部的贯通突出部的微孔。这里，在突出部的空洞的内部，填充了铟、镓、或者铟与镓的合金等的流体。在使用微细加工装置时，通过对悬臂施加脉冲电压，流体经过微孔流向外部，在试样的表面形成^或( 等的超微小点或超微细线。这样，制作出高速光通信用的半导体发光元件等。
但是，在现有的生物试样操作装置80中，由于有必要将需要导入到细胞84内的基因等固定在针状物83的端头，所以存在下述这样的问题，即，不能对细胞84注入或者滴加溶入有基因或药品等的药液或反应性气体等的流体。
另外，因为将直径为IOnm 30nm左右的针状物83插入到细胞内，所以在细胞膜 85上开设比该针状物83的直径大的孔86，另外，有时针状物83给细胞核87带来损伤。由此也存在下述这样的问题，即，细胞84受到大的损伤而死亡，或者即使通过细胞84的自修复功能修复了孔86或损伤，该修复也需要长的时间。
专利文献1 日本专利申请公开号特开2003-325161号公报
专利文献2 日本专利申请公开号特开2004-34277号公报
发明内容
本发明是鉴于这样的问题而完成的发明，其目的在于提供一种可以对生物试样注入或者滴加溶入了基因等的药液等的流体，并且，将此时带给生物试样的损伤控制在最小限度的手段。
本发明涉及的生物试样操作方法，是将生理活性物质或者激发化学反应的物质注入到生物试样内的生物试样操作方法，其特征在于，在扫描型探针显微镜中装备悬臂，所述悬臂是具备基端被单端支持了的梁部、突出设置于该梁部并在内部设置了空洞的探针、从上述空洞向上述探针的外部贯通上述探针而形成的微孔、设置在上述空洞内的第1电极而成的；在上述悬臂的上述空洞内填充含有生理活性物质或激发化学反应的物质的具有导电性的流体；在由导电性薄膜构成的第2电极上载置生物试样，并且使上述悬臂的上述探针接近该生物试样；通过在上述第1电极与上述第2电极之间施加脉冲电压，使上述流体从上述微孔流出，并且注入到生物试样内；用上述扫描型探针显微镜观测生物试样的表面的形状变化。
根据本发明，通过向流体施加脉冲电压，使得作用于构成流体的各粒子间的结合力被切断，失去了凝聚力的流体从微孔中流出。另外，通过对生物试样施加脉冲电压，产生瞬间性的绝缘破环，从而在生物试样的表面开孔，流体通过电泳经孔被摄入到生物试样内。 另外，因为该孔非常微小，可以立即通过生物试样的自修复功能修复，所以也不会给生物试样带来大的损伤。由此，可以尽可能地降低给生物试样带来的损伤，并且将流体注入到生物试样内。
另外，本发明是将生理活性物质或者激发化学反应的物质滴加在生物试样上的生物试样操作方法，其特征在于，在扫描型探针显微镜中装备悬臂，所述悬臂是具备基端被单端支持了的梁部、突出设置于该梁部并在内部设置了空洞的探针、从上述空洞向上述探针的外部贯通上述探针而形成的微孔、设置在上述空洞内的第1电极和第2电极而成的；在上述悬臂的上述空洞内填充含有生理活性物质或激发化学反应的物质的具有导电性的流体; 使上述悬臂的探针接近生物试样；通过在上述第1电极与上述第2电极之间施加脉冲电压， 使上述流体从上述微孔流出，并且滴加在生物试样上；用上述扫描型探针显微镜观察生物试样的表面的形状变化。
根据本发明，通过对流体施加脉冲电压，可以切断作用于构成流体的各粒子间的结合力，使流体从微孔流出。
另外，本发明的特征在于，在扫描型探针显微镜中分别装备了上述悬臂。根据本发明，在对生物试样进行操作后，可以确认药液等是否确实注入或滴加于生物试样内，还可以确认由于施加脉冲电压而导致生物试样的损坏情况达到怎样的程度等。
另外，本发明的特征在于，用光学显微镜观测上述生物试样的操作和操作后的上述生物试样的内部变化。根据本发明，可以容易地从多个排列的生物试样中选择出需要操作的生物试样，并且，可以一边用操作观测单元观测，一边更准确地操作生物试样。另外，也可以观测在操作后的生物试样中产生的内部变化。
[图1]是显示本发明实施方式所涉及的生物试样操作装置1、30、40、50、60的模式图。
[图2]是对图1中细胞2的附近进行了放大的部分放大截面图。
[图3]是显示第1实施方式涉及的悬臂9的构成的概略立体图。
[图4]是显示第2实施方式涉及的悬臂31的构成的概略立体图。
[图5]是显示第3实施方式涉及的悬臂41的构成的概略立体图。
[图6]是显示第4实施方式涉及的悬臂51的构成的概略立体图。
[图7]是显示第5实施方式涉及的悬臂61的构成的概略立体图。
[图8]是显示现有例涉及的生物试样操作装置80的概略侧面图。
[图9]是说明在各图中使用的引用符号的附页。
具体实施方式
以下，根据
本发明的第1实施方式。图1是显示本实施方式涉及的生物试样操作装置1的模式图。如图所示的那样，生物试样操作装置1是具备下述单元而构成的，所述单元为用于对作为操作对象的细胞(生物试样)2进行操作、同时观测该细胞2的表面变化的原子力显微镜(以下，称作“AFM”)3、对该AFM3施加脉冲电压的脉冲电源4、控制AFM3和脉冲电源4的动作的控制部5、作为该控制部5的输入输出部的计算机6，和用于观测细胞操作和操作后的细胞2的内部变化的光学显微镜(操作观测单元)7。另外，在本实施方式中，使用作为生物试样的一个例子的细胞2进行说明，但除此以外，也可以使用例如生物的组织片、蛋白·酶等的生物高分子。
AFM3是扫描型探针显微镜的一种，其用于观测细胞2的表面形状、并且对该细胞2 进行操作。如图1所示的那样，该AFM3具备载置细胞2的扫描台8，和对该扫描台8上的细胞2的表面进行扫描的悬臂9。
图2是对图1中细胞2的附近进行了放大的部分放大截面图。如图1和图2所示的那样，扫描台8具有内置了没有图示的压电元件致动器的台主体10、在该台主体10的最上部配置的玻璃板11、和在该玻璃板11的上面贴设的透明导电性薄膜(第2电极)12。通过在细胞2已被载置在导电性薄膜12上的状态下，对压电元件致动器施加电压以使之伸缩，扫描台8可以使细胞2在XYZ轴方向移动。另外，如图1所示的那样，在台主体10上， 形成了沿上下方向贯通该台主体10的空隙13，在该空隙13的下方配置有上述光学显微镜 7。由此，可以用光学显微镜7观测通过玻璃板11和导电性薄膜12对细胞2进行操作的情形和在细胞2内产生的变化等。
图3是显示悬臂9构成的概略立体图。如图1 图3所示的那样，悬臂9具有基端被支架14单端支持了的梁部15、突出设置在该梁部15的端头并设置空洞16而成的探针 17、在该探针17的内壁面涂布的覆盖物18、在空洞16内填充的药液19、从梁部15的表面向探针17的内壁面配置的导电性薄膜(第1电极)20，和从空洞16向探针17的外部贯通探针17而形成的微孔21。
探针17通过与细胞2的表面距离极微小地接近来检测其表面形状。如图3所示的那样，该探针17具有四角锥形状，从该四角锥的底面侧向顶点侧形成了四角锥形状的空洞16。另外，覆盖物18通过降低上述药液19的表面张力，使药液19易于从微孔21向外部流出。在本实施方式中，在探针17的内壁面涂布金来形成薄膜。另外，在本发明中，覆盖物 18为任意的构成，其成分、膜厚等可以适当地进行设计改变。另外，药液19是将DNA等的核酸物质、或者抗原 酶 激素等的蛋白物质(以下，将它们称为“生理活性物质”)溶解在缓冲液中形成的溶液，其具有导电性。由于微孔21的开口径超微小，并且构成药液19的各粒子通过原子力等的作用相互结合，所以该药液19不能通过微孔21流到探针17的外部，而是被保持在探针17内。另外，药液19也可以是本实施方式以外的溶液，例如是通过微量滴加在细胞2上来激发化学反应这样的溶液。另外，微孔21起到使在空洞16内填充的药液 19流出到探针17的外部的流出口的作用。该微孔21的横截面为圆形，是开口径为20 500nm的超微小孔。如图3所示的那样，该微孔21从空洞16的顶点向探针17的顶点而形成。因此，探针17其顶点缺失，其端头由微孔21的截面构成，通过使该截面距离极微小地接近细胞2的表面来扫描其形状。另外，通过改变微孔21的横截面大小，可以调节药液19的流出量。另外，导电性薄膜20用于对药液19和细胞2施加脉冲电压。如图2和图3所示的那样，该导电性薄膜20在梁部15的上面沿其长度方向贴设，其前端部向下方弯曲，沿着探针17的内壁面贴设。因此，当在空洞16内填充了药液19时，变成导电性薄膜20的前端部与药液19接触的状态。
脉冲电源4对药液19和细胞2施加脉冲电压。如图1和图2所示的那样，该脉冲电源4分别与悬臂9的导电性薄膜20和扫描台8的导电性薄膜12连接，从而在导电性薄膜20与导电性薄膜12之间施加脉冲电压。这里，因为药液19具有导电性，另外，构成细胞 2的细胞膜22和细胞液23也具有导电性，所以在导电性薄膜20与导电性薄膜12之间有电流流通。此时，作用于构成药液19的各粒子间的结合力由于受到电击而被切断，失去了凝聚力的药液19通过微孔21向探针17的外部流出。该药液19的流出量可以通过控制脉冲电压的大小来调节。进而，由于在细胞2中也有电流流通，所以通过瞬间性的绝缘破坏而在细胞膜22上打开了微细的破坏孔M，因脉冲电压而产生电泳的药液19通过细胞膜22的破坏孔M进入到细胞2内。因为在该细胞膜22上产生的破坏孔M非常微细，所以该孔可以通过细胞2的自修复功能立即封闭，细胞2不会受到大的损伤。这样，在空洞16内填充的药液19被注入到细胞2内。另外，本实施方式是将从微孔21流出的药液19注入到细胞2 中，但不限于此，也可以将流出的药液19滴加到细胞2上。在该情况下，没有详细的图示， 如果设置一对电极使电极均与药液19接触，并在该各电极间施加脉冲电压，则细胞2不发生绝缘破坏，流出的药液19不能进入到细胞2内，而被滴加到细胞2上。另外，作为将作用于药液19的各粒子间的结合力切断的方法，除了如本实施方式那样对药液19给予电击以外，例如也可以使用利用脉冲激光给予机械冲击的方法。
控制部5控制上述AFM3和上述脉冲电源4的动作。该控制部5沿水平方向，即XY 轴方向对扫描台8进行扫描，这期间控制沿Z轴方向即垂直方向的扫描，并使作用在悬臂9 的探针17与细胞2之间的原子力恒定。此时，检测与扫描台8的XY轴方向的位置对应的Z 轴方向的反馈量来作为控制部5的输出电压，通过计算机6的没有图示的演算单元将其以 3维图像的形式输出到画面上，由此，可以超精密地测定细胞2的表面形状。另外，在本实施方式中，通过固定悬臂9的位置并使扫描台8移动来扫描细胞2的表面，但也可以与此相反，通过固定扫描台8的位置，使悬臂9移动来扫描细胞2的表面，在该情况下，用控制部5 控制悬臂9的动作即可。另外，控制部5也控制上述脉冲电源4的动作，可以一边对扫描台 8进行扫描以观测细胞2的表面，一边在悬臂9到达希望的位置时，施加电压脉冲，向细胞2 注入或者滴加药液19。另外，在本实施方式中，是以在扫描台8上载置1个细胞2的情况为例进行说明，但是也可以在扫描台8上排列多个细胞2，仅对选自其中的任意的细胞2注入或者滴加药液19。这样，将药液19注入细胞2后，用AFM3观测细胞2的表面形状，可以确认药液19是否确实注入到了细胞2内，还可以确认因施加脉冲电压而导致的细胞2的损坏情况达到怎样的程度等，从而能够更准确地进行细胞操作。
以下，对使用生物试样操作装置1进行细胞操作的顺序进行说明。首先，将注入或者滴加于细胞2内的规定的药液19预先填充到悬臂9的空洞16内。接着，将作为操作对象的细胞2载置在扫描台8上，一边用光学显微镜7观测，一边进行位置调节以使悬臂9的探针17处于细胞2的正上方。接着，沿Z轴方向对扫描台8进行扫描、使探针17接近细胞 2，然后沿XY轴方向对扫描台8进行扫描，当探针17到达希望的位置时，操作脉冲电源4，在各导电性薄膜12、20之间施加规定大小的脉冲电压。由此，药液19从悬臂9的微孔21处流出，注入或者滴加于细胞2。之后，用AFM3观测细胞2表面的形状变化，同时用光学显微镜7观测在细胞2内产生的变化，例如注入到细胞2内的基因表达的情况。
接着，基于附图来说明本发明的第2实施方式。本实施方式涉及的生物试样操作装置30，与第1实施方式的生物试样操作装置1相比，其特征在于，悬臂31的构成不同，对于除此以外的构成，与第1实施方式相同，这里省略其详细说明。图4是显示本实施方式涉及的悬臂31的构成的概略立体图。另外，在图4中，对于与图3同样的构成赋予相同的符号。如图4所示的那样，悬臂31具有基端被支架14单端支持了的梁部15、突出设置在该梁部15的前端并设置空洞16而成的探针17、在探针17的内壁面涂布的覆盖物18、在空洞 16的内部填充的药液19、从梁部15的表面向探针17的内壁面配置的导电性薄膜20、和连通空洞16与探针17的外部的微孔32。
在该悬臂9中，微孔32不是位于空洞16的顶点与探针17的顶点的连接线上，而是在稍微偏离该连接线的位置处形成的。由此，探针17的顶点没有缺失，以尖锐形状的探针点33的形式残留。由于所形成的该探针点33其曲率半径约为IOnm左右，所以与由具有 20 500nm左右的开口径的微孔21构成探针17的前端的上述悬臂9相比较，该探针点33 能够以更高的分辨率扫描细胞2的表面。这里，为了使药液19可以更准确地向探针点33 指定的规定位置流出，优选在离探针点33更近的位置形成微孔32。
接着，基于附图来说明本发明的第3实施方式。本实施方式涉及的生物试样操作装置40，其特征在于，与第1实施方式的生物试样操作装置1相比，悬臂41的构成也不同， 对于除此以外的构成，与第1实施方式相同，这里省略其详细说明。图5是显示本实施方式涉及的悬臂41的构成的概略立体图。另外，在图5中，对于与图3同样的构成赋予相同的符号。如图5所示的那样，悬臂41具有基端被支架14单端支持了的梁部15、突出设置在该梁部15的端头并设置空洞16而成的探针17、在该探针17的内壁面涂布的覆盖物18、在空洞16的内部填充的药液19、从梁部15的表面向探针17的内壁面配置的导电性薄膜20、连通空洞16与探针17的外部的微孔21，和在探针17的端头部设置的作为探针点发挥功能的突起部42。
在该悬臂41中，与第1实施方式的悬臂9 一样，微孔21从空洞16的顶点向探针 17的顶点形成，探针17其顶点缺失。另一方面，突起部42形成为具有尖锐的角部43的三角形状，该尖锐角部43位于微孔21的下方，其一端部边缘固定在探针17的外壁面。通过使该突起部42的尖锐角部43极为接近细胞2的表面，与第1实施方式的悬臂9相比，能够以更高的分辨率扫描细胞2的表面。另外，突起部42只要具有尖锐角部43即可，其形状不限定于三角形，可以进行适当的设计改变。
接着，基于附图来说明本发明的第4实施方式。本实施方式涉及的生物试样操作装置50，其特征在于，与第1实施方式的生物试样操作装置1相比，悬臂51的构成也不同， 对于除此以外的构成，与第1实施方式相同，这里省略其详细说明。图6是显示本实施方式涉及的悬臂51的构成的概略立体图。另外，在图6中，对于与图3同样的构成赋予相同的符号。如图6所示的那样，悬臂51具有基端被支架14单端支持了的梁部15、突出设置在该梁部15的端头并设置空洞16而成的探针17、在该探针17的内壁面涂布的覆盖物18、在空洞16的内部填充的药液19、从梁部15的表面向探针17的内壁面配置的导电性薄膜20、连通空洞16与探针17的外部的微孔21，和安装在探针17的端头部的纳米管52。
在该悬臂51中，微孔21与第1实施方式涉及的悬臂9 一样，从空洞16的顶点向探针17的顶点而形成，探针17其顶点缺失。另一方面，纳米管52由碳等构成，其基端部固定在探针17的外壁面，其端头部突出设置在探针17的端头下方。该纳米管52的开口径极其微小，通过使其前端距离极微小地接近细胞2的表面，使得与第1实施方式的悬臂9相比， 能够以更高的分辨率扫描细胞2的表面。
接着，基于附图来说明本发明的第5实施方式。本实施方式涉及的生物试样操作装置60，与第1实施方式的生物试样操作装置1相比，其特征在于，悬臂61的构成也不同， 对于除此以外的构成，与第1实施方式相同，这里省略其详细说明。图7是显示本实施方式涉及的悬臂61的构成的概略立体图。另外，在图7中，对于与图3同样的构成赋予相同的符号。如图7所示的那样，悬臂61具有基端被支架14单端支持了的梁部15、突出设置在该梁部15的端头并设置空洞16而成的探针17、在该探针17的内壁面涂布的覆盖物18、在没有图示的容器内填充的反应性气体(流体)62、将该反应性气体62输送给悬臂61的输送喷嘴63、从梁部15的表面向探针17的内壁面配置的导电性薄膜20、和连通空洞16与探针 17的外部的微孔21。
反应性气体62是与即使在真空中也不蒸发的物质的表面激发各种化学反应的气体状物质的总称，其当然包括单体，也包括化合物和混合物等。作为该反应性气体62，可以使用例如，以HF或者HCl为代表的卤素气体、以C4H5N或者CH3CH2CN为代表的氰化气体等，除此以外，在常温下为固体或液体的物质可以通过加热等气化后使用。该反应性气体62 虽然未在图中详细示出，但被填充在作为真空腔的上述容器内。另一方面，输送喷嘴63其一端与上述容器连接，同时其另一端收缩得很细并插进悬臂61的空洞16内。由于微孔21 的开口径超微小，并且构成反应性气体62的各粒子通过原子力等的作用互相结合，所以从该输送喷嘴63喷射的反应性气体62与上述药液19 一样，不能通过微孔21喷出到探针17 的外部，而是滞留在空洞16内。另外，通过从导电性薄膜20对该反应性气体62施加脉冲电压，各粒子间的结合力被切断，反应性气体62流出到探针17的外部。这样，通过使反应性气体62从微孔21流出并附着在细胞2的表面，从而激发细胞2与反应性气体62之间的各种化学反应，并通过AFM3或光学显微镜7观测该变化。
产业上的可利用性
在本发明中，不限于原子力显微镜，也可以使用配备在其他扫描型探针显微镜中的悬臂。
权利要求
1.一种生物试样操作方法，是将生理活性物质或者激发化学反应的物质注入到生物试样内的生物试样操作方法，其特征在于，所述生物试样是细胞、生物的组织片和生物高分子，在扫描型探针显微镜中装备悬臂，所述悬臂是具备基端被单端支持了的梁部、突出设置于该梁部并在内部设置了空洞的探针、从上述空洞向上述探针的外部贯通上述探针而形成的微孔、设置在上述空洞内的第1电极而成的，在上述悬臂的上述空洞内填充含有生理活性物质或激发化学反应的物质的具有导电性的流体，在由导电性薄膜构成的第2电极上载置生物试样，并且使上述悬臂的上述探针接近该生物试样，通过在上述第1电极与上述第2电极之间施加脉冲电压，使上述流体从上述微孔流出， 并且注入到生物试样内，用上述扫描型探针显微镜观测生物试样的表面的形状变化。
2.一种生物试样操作方法，是将生理活性物质或者激发化学反应的物质滴加在生物试样上的生物试样操作方法，其特征在于，在扫描型探针显微镜中装备悬臂，所述悬臂是具备基端被单端支持了的梁部、突出设置于该梁部并在内部设置了空洞的探针、从上述空洞向上述探针的外部贯通上述探针而形成的微孔、设置在上述空洞内的第1电极和第2电极而成的，在上述悬臂的上述空洞内填充含有生理活性物质或激发化学反应的物质的具有导电性的流体，使上述悬臂的探针接近生物试样，通过在上述第1电极与上述第2电极之间施加脉冲电压，使上述流体从上述微孔流出， 并且滴加在生物试样上，用上述扫描型探针显微镜观察生物试样的表面的形状变化。
3.如权利要求
1或2所述的生物试样操作方法，其特征在于，用光学显微镜观测上述生物试样的操作和操作后的上述生物试样的内部变化。 2
专利摘要
本发明涉及一种生物试样操作方法，其特征在于，在扫描型探针显微镜(3)中装备悬臂(9)，所述悬臂(9)是具备基端被单端支持了的梁部(15)、突出设置于该梁部(15)并在内部设置了空洞(16)的探针(17)、从空洞(16)向探针(17)的外部贯通探针(17)而形成的微孔(21)、设置在空洞(16)内的第1电极(20)而成的；在悬臂(9)的空洞(16)内填充含有生理活性物质或激发化学反应的物质的具有导电性的流体(19)；在由导电性薄膜构成的第2电极(12)上载置生物试样(2)，并且使悬臂(9)的探针(17)接近该生物试样(2)；通过在第1电极(20)与第2电极(12)之间施加脉冲电压，使流体(19)从上述微孔(21)流出，并且注入到生物试样(2)内；用扫描型探针显微镜观测生物试样(2)的表面的形状变化。
文档编号C12N5/06GKCN1954064 B发布类型授权 专利申请号CN 200480043116
公开日2012年2月1日 申请日期2004年5月26日
发明者长村俊彦 申请人:株式会社优尼索库导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2),