专利名称:小干扰rna的细胞转染制剂、相关组合物以及制备和使用方法
小干扰RNA的细胞转染制剂、相关组合物以及制备和使用
方法
发明领域
本发明涉及含有小干扰核糖核酸(SiRNA)和脂质-偶联的聚酰胺化合物的组合物，其制备方法，以及用于将siRNA递送给细胞的方法。本发明也涉及适合用于将多核苷酸，包括siRNA递送给细胞的新型脂质-偶联的聚酰胺化合物。
相关申请的交叉参考
本申请要求2003年12月19日提交的美国临时申请号60/530，953的优先权，将其全文纳入本文作为参考。
发明背景
RNA干扰指细胞中双链RNA的存在消除了序列相同的基因表达，而不干扰其它无关基因表达的现象。在植物中已有一段时间注意到这种也称为“转录后基因沉默”或“RNA 沉默”的现象，但最近才在动物中发现。？丨1^等，妝^11^，391，806(1998)。这种功能的发现提示，这可能是停止特定蛋白产生的有效研究工具并可通过此机制进行基因特异性治疗。
最近阐明了 RNA干扰机制的细节。细胞中存在的长dsRNA能刺激称为切酶的核糖核酸酶III的活性。切酶参与将dsRNA加工成短片段dsRNA，称为小干扰RNA(siRNA) (Berstein等，Nature, 409, 363 (2001)) 0切酶活性所产生的小干扰RNA的长度一般约为 21-23个核苷酸。RNAi反应也是含有siRNA的核酸内切酶复合物，通常称为RNA-诱导的沉默复合物(RISC)的特征。该RISC复合物介导含有siRNA双链体的反义链的互补序列的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体反义链互补的区域的中部。Elkishir 等，Genes Dev.，15，188 (2001)。
在哺乳动物细胞中利用该现象的一种可能阻碍是这些细胞中存在的长dsRNA也刺激干扰素反应，导致mRNA被核糖核酸酶非特异性切割。然而，已证明，化学合成的21 聚体小干扰RNA(SiRNA)在几株人细胞系中能有效抑制基因表达而不引起干扰素反应。 Elkishir等，Nature, 411,494 (2001) 0具体说，发现含有两个TT核苷酸3，-突出端的21 个核苷酸双链体的合成性siRNA活性最高。Elkishir等，EMBO J. ,20,6877(2001)。
SiRNA的高特异性、对核糖核酸酶的抗性、无免疫原性和强效特征说明，它在非常可能在研究和治疗应用中作为细胞转染制剂。已有各种方案可将核酸组合物递送给细胞。 然而，将siRNA转染入细胞则遇到了技术困难。病毒载体提供相对有效的递送，但一些情况下存在安全性问题，因为给予的患者存在发生免疫并发症或有害增殖的风险。腺病毒载体显示出某些优点，它们不会整合入细胞基因组中而可转导入静止细胞中。然而，所有这些载体必须通过耗时的重组DNA技术制备。也可通过化学转染制剂将寡核苷酸递送给细胞，近年来此主题已作了许多研究。这些制剂包括聚阳离子分子如聚赖氨酸，和阳离子脂质。广泛采用的脂质体组合物Lipofectin (Feigner等，PNAS84 :7413，含有阳离子脂质 DOTMA (N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵)和中性磷脂DOPE (二油酰磷脂酰乙醇胺)。其它方法，如磷酸钙介导的转染可按照报道的方法将寡核苷酸递送给细胞。 然而，需要易于使用和可应用于许多细胞类型的有效、无毒的siRNA转染制剂。
4[0009]发明概述
为了实现上述目的，本发明提供含有小干扰核糖核酸(SiRNA)和将多核苷酸包括 siRNA递送给细胞特别有用的某些脂质-偶联的聚酰胺化合物的递送运载体的组合物。
在一个方面，本发明提供含有小干扰核糖核酸(siRNA)和具有以下通式的脂质-偶联的聚酰胺化合物的组合物
(I) Ra-[(NR1-W-CO) Jm-Rc
通式中η是1至约48的整数，m是约2至约48的整数，
通式中各单体单元-(NR1-W-CO)-的R1和Ra独立地选自氢原子；羟基；氨基；羧基；磺酰基；-SH ；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有1-8个碳原子的任选取代的、 支链或直链脂族基团，其中所述脂族基团任选地具有一个或多个双键或三键；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳基；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳烷基，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和任选地连接有接头部分的脂质部分，
通式中至少一个单体单元的R1不是氢原子，
通式中I 。选自氢原子；轻基；氨基；胼基；磺酰基；-SH ；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有1-8个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族基团，其中所述脂族基团任选地具有一个或多个双键或三键；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳基；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳烷基，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和任选地连接有接头部分的脂质部分，
通式中当礼、Ra或R。是主链结构中碳原子少于5个的芳基或芳烷基时，所述主链结构还包含一个或多个氧和/或氮原子，
通式中各单体单元的W独立地选自在含有碳且在任选含有氮、氧、硫和磷的主链中具有1至约50个原子和任选的一个或多个双键或三键的任选取代的、支链或直链二价部分，所述W的任选取代基可以是任选地连接有接头部分的脂质部分，
通式中所述脂质部分是疏水性或两性部分，选自
(i)在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有约14至约50个碳原子的任选取代的芳基或芳烷基部分，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和
(ii)在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有约10至约50个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族部分，其中所述脂族部分任选地具有一个或多个双键或三键，和
通式中一个单体单元的民、I 。、W中至少一个和一个单体单元的R1包含脂质部分。
在一个具体实施方式
中，本发明提供在药学上可接受的运载体中包括SiRNA的组合物。该组合物可用于体外或体内将siRNA递送给细胞，以抑制感兴趣基因的表达。该运载体包括一种或多种下式的脂质-阳离子类肽偶联物
(VI) L-X- [N (CH2CHaNH2) CH2 (C = 0) -N (CH2CH2R) CH2 (C = 0) N (CH2CH2R) CH2 (C = 0)]3-ΝΗ2和位置异构体
式中
L选自包含至少一个长度约8-M个碳原子的脂族烷基或烯基链的非类固醇脂质部分，和固醇部分；[0027]基团R各自独立地选自烷基、氨基烷基和芳烷基，
X选自直接键连接、寡肽、长度为2至约30个键的基本线性的烷基链，和长度为2 至约30个键由烷基键和选自酯键、酰胺键、碳酸酯键、氨基甲酸酯键、二硫键、肽键和醚键的一个或多个键连接组成的基本线性的链。
当L是非固醇脂质部分(即脂质部分不是或不含固醇基团如磷脂基团(即 R00CCH2CH(COOR) CH2OP (O)2O-)时，该脂质-阳离子聚酰胺偶联物在本文中称为“类脂”。当 L是固醇部分(即是或含有固醇基团如胆固醇基团的脂质部分)时，该脂质-阳离子聚酰胺偶联物在本文中称为“类胆固醇”。本发明组合物中的脂质-阳离子类肽偶联物可以是类脂、类胆固醇或(在一个重要实施方式中)其组合。
在具体实施方式
中，R是异丙基或4-甲氧基苯基。单个类脂或类胆固醇可包括不同基团R，或者它们在分子中可以相同。
本发明组合物可导致将生物活性SiRNA有效递送给哺乳动物细胞，有效敲除靶基因的mRNA。
在另一方面，提供了抑制对象中靶基因表达的方法，该方法包括给予对象上述组合物，其中siRNA双链体的一条链含有靶基因衍生的mRNA中的核苷酸序列。在一个具体实施方式
中，siRNA双链体的一条链包括本文公开的SEQ ID NO=I代表的序列，靶基因/mRNA 是Aktl。
在另一方面，本发明提供由至少一种类脂和一种类胆固醇的混合物组成的多核苷酸递送运载体。这种组合了类脂/类胆固醇的递送运载体适合用于将各种多核苷酸如质粒 DNA、反义寡核苷酸和siRNA以含有这些多核苷酸和组合的类脂/类胆固醇的递送运载体的组合物(方式)递送给细胞。
考虑能提供制造本文所述化合物和组合物的方法都属于本发明范围内，用该方法制备的组合物可作为本发明方法所用的药物。
当结合附图阅读以下本发明详述时，将更全面地明白本发明的这些和其它目的和特征。
附图简要说明
图1显示在本发明组合物和方法中用作siRNA运载体的脂质-阳离子类肽偶联物 (“类脂”和“类胆固醇”)的选择。
图2是显示采用本发明的转染组合物将针对Aktl mRNA的siRNA转染入乳腺癌细胞中时Aktl表达缺失的图。
图3是显示采用本发明针对萤火虫荧光素酶的siRNA和几种不同的递送运载体制备的转染混合物处理的细胞中荧光素酶活性的图。 具体实施方式
的描述
现在参照几个实施方式描述本发明的材料和相关的技术和装置。在文本结构中说明所述实施方式的重要特性和特征。虽然将结合这些实施方式描述本发明，但应理解本发明不受这些实施方式的限制。相反，本发明覆盖了它们的替代方式、修改和等价形式，包括在本文所附权利要求
书所限定的本发明构思和范围内。在以下描述中，列出了许多特定细节，以提供对本发明的完整理解。可在没有这些特定细节的一些或全部情况下实施本发明。 在其它情况下，未详述熟知的工艺操作，以避免不必要地混淆本发明的内容。
6[0042]内容介绍
本发明提供含有小干扰核糖核酸(SiRNA)和将SiRNA递送给细胞特别有用的脂质偶联的聚酰胺递送运载体的组合物。在另一方面，本发明提供了由至少一种类脂和一种类胆固醇的混合物组成的多核苷酸递送运载体。该递送运载体适合用于将各种多核苷酸，如质粒DNA、反义寡核苷酸和siRNA递送给细胞。
在一个方面，本发明提供含有小干扰核糖核酸(siRNA)和具有以下通式的脂质-偶联的聚酰胺化合物的组合物
(I) Ra- [ (NR1-W-CO) n] m_Rc
通式中η是1至约48的整数，m是约2至约48的整数，
通式中各单体单元-(NR1-W-CO)-的R1和Ra独立地选自氢原子；羟基；氨基；羧基；磺酰基；-SH ；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有1-8个碳原子的任选取代的、 支链或直链脂族基团，其中所述脂族基团任选地具有一个或多个双键或三键；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳基；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳烷基，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和任选地连接有接头部分的脂质部分，
通式中至少一个单体单元的R1不是氢原子，
通式中I 。选自氢原子；轻基；氨基；胼基；磺酰基；-SH ；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有1-8个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族基团，其中所述脂族基团任选地具有一个或多个双键或三键；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳基；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳烷基，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和任选地连接有接头部分的脂质部分，
通式中当礼、Ra或R。是主链结构中碳原子少于5个的芳基或芳烷基时，所述主链结构还包含一个或多个氧和/或氮原子，
通式中各单体单元的W独立地选自含有碳且在任选含有氮、氧、硫和磷的主链中具有1至约50个原子和任选的一个或多个双键或三键的任选取代的、支链或直链二价部分，其中所述W的任选取代基可以是任选地连接有接头部分的脂质部分，
通式中所述脂质部分是疏水性或两性部分，选自
(i)在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有约14至约50个碳原子的任选取代的芳基或芳烷基部分，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和
(ii)在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有约10至约50个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族部分，其中所述脂族部分任选地具有一个或多个双键或三键，和
通式中一个单体单元的民、I 。、W中至少一个和一个单体单元的R1包含脂质部分。
在一个具体实施方式
中，本发明提供在药学上可接受的运载体中包含siRNA的组合物。该组合物可用于体外或体内将siRNA递送给细胞，以抑制感兴趣基因的表达。该运载体包括一种或多种下式的脂质-阳离子类肽偶联物
(VI) L-X- [N (CH2CH2NH2) CH2 (C = 0) -N (CH2CH2R) CH2 (C = 0) N (CH2CH2R) CH2 (C = 0)]3-ΝΗ2和位置异构体
式中
7[0059]L选自包含至少一个长度约8-M个碳原子的脂族烷基或烯基链的非类固醇脂质部分，和一个固醇部分；
基团R各自独立地选自烷基、氨基烷基和芳烷基，
X选自直接键连接、寡肽、长度为2至约30个键的基本线性的烷基链，和长度为2 至约30个键的由烷基键和选自酯键、酰胺键、碳酸酯键、氨基甲酸酯键、二硫键、肽键和醚键的一个或多个键连接组成的基本线性的链。
当L是非固醇脂质部分(即脂质部分不是或不含固醇基团如磷脂基团(即 R00CCH2CH(COOR) CH2OP (O)2O-)时，该脂质-阳离子聚酰胺偶联物在本文中称为“类脂”。当 L是固醇部分(即是或含有固醇基团如胆固醇基团的脂质部分)时，该脂质-阳离子聚酰胺偶联物在本文中称为“类胆固醇”。本发明组合物中的脂质-阳离子类肽偶联物可以是类脂、类胆固醇或(在一个重要实施方式中)其组合。
在具体实施方式
中，R是异丙基或4-甲氧基苯基。一个类脂或类胆固醇可包括不同基团R，或者它们在分子中可以相同。
本发明组合物可导致将生物活性SiRNA有效递送给哺乳动物细胞，而有效敲除靶基因的mRNA。
在另一方面，提供了抑制对象中靶基因表达的方法，该方法包括给予对象上述组合物，其中siRNA双链体的一条链含有靶基因衍生的mRNA中的核苷酸序列。在另一具体实施方式
中，提供了制造上述用于在对象中抑制靶基因表达的组合物的方法。在一具体实施方式
中，siRNA双链体的一条链包含本文公开的SEQ ID NO :1代表的具有两个核苷酸3’-突出端和全部磷酸二酯键连接的序列，所述靶基因/mRNA是Aktl。
在另一方面，本发明提供由至少一种类脂和一种类胆固醇的混合物组成的多核苷酸递送运载体。这种组合了类脂/类胆固醇的递送运载体适合用于将各种多核苷酸如质粒 DNA、反义寡核苷酸和siRNA以含有这些多核苷酸和组合的类脂/类胆固醇的递送运载体的组合物(方式)递送给细胞。
本发明组合物和递送运载体可体外使用，例如与研究，包括药物发现、开发和测试活动结合使用，或体内用于动物，包括哺乳动物(如人)对象的治疗应用(如作为治疗疾病的药物组分中的药物)。在这些体内应用中，采用本发明的药学上可接受的运载体。
定义
除非另有说明，本文所用术语应具有本领域技术人员所理解的通常涵义。为了有助于理解本发明，本文中使用许多定义的术语来指代本发明的具体元素。当这样使用时，其涵义如下
本文所用术语“脂质偶联的聚酰胺”指具有低聚酰胺部分和一个或多个脂质部分的化合物。脂质-偶联的聚酰胺化合物中的聚酰胺组分可能是，例如类肽，在这种情况下脂质偶联的聚酰胺可称为“脂质偶联的类肽”，如果具体是阳离子类肽，在这种情况下脂质偶联的聚酰胺可称为“脂质-阳离子类肽偶联物”。
本文所用术语“脂质”指疏水性或两性部分。脂质部分可直接偶联于低聚酰胺部分，或任选地通过接头部分间接偶联于低聚酰胺部分。脂质偶联的聚酰胺的脂质部分可以是或含有非固醇或固醇的部分。
本文所用术语“类脂”指下式的脂质偶联的类肽[0073](VI) L-X- [N (CH2CH2NH2) CH2 (C = 0) -N (CH2CH2R) CH2 (C = 0) N (CH2CH2R) CH2 (C = 0) I3-NH2
其中脂质部分L是非固醇脂质部分。无论用于本文的说明书和权利要求
书，该式均覆盖其位置异构体或类肽部分，位置异构体是该式类肽部分的任何重复的三倍基序。
本文所用术语“类胆固醇”指下式的脂质偶联的类肽
L-X- [N (CH2CH2NH2) CH2 (C = 0) -N (CH2CH2R) CH2 (C = 0) N (CH2CH2R) CH2 (C = 0) ] 3_NH2
其中脂质部分L是固醇脂质部分。无论用于本文的说明书或权利要求
书，该式均覆盖其位置异构体和类肽部分，位置异构体是该式类肽部分的任何重复的三倍基序。
术语“低聚”和“低聚酰胺”在本文中可互换使用，指通过酰胺键连接在一起的两个或多个单体单元，
即-[(M1-W-CO)n]m_。
本文所用术语“单体”或“单体”单元指下式定义的单元
- (NR1-W-CO)-。
本文所用术语“低聚反应物”、“低聚反应物”、“低聚酰胺反应物”和“脂质反应物” 指合成的本发明脂质偶联的聚酰胺化合物产生的反应性物质。
本文所用术语“递送运载体”指脂质-偶联的聚酰胺化合物，如本文进一步描述， 它与多核苷酸形成复合物而有助于将多核苷酸通过细胞膜递送至靶位点。本发明的递送运载体是“药学上可接受的”，本文所用“药学上可接受的”指该递送运载体与生物物质相容， 以用于药物剂型和其它体内或体外应用，在这些应用中它们与生物物质如活细胞相接触。
本文所用术语“复合物”指两种或多种化合物或结构之间通过相互作用所形成的结构。这些相互作用可通过化学相互作用，例如共价键、离子键或次级键(如氢键)等，或通过物理相互作用，例如包裹、截留等。
根据本发明的一个方面，脂质-偶联的聚酰胺化合物可通过与位于中间的易受内源性蛋白水解酶降解的氨基酸序列的共价键与siRNA形成复合物。因此，例如，该复合物接触降解酶会导致切割，然后从该复合物中释放出siRNA。本发明的脂质-偶联的聚酰胺化合物也可通过离子或次级键，或者通过包裹或截留与siRNA形成复合物。
术语“多核苷酸”和“多聚核酸”在本文中可互换使用，指DNA、RNA及其类似物、 肽-核酸，以及具有不含磷酸的核苷酸的DNA或RNA。siRNA特别用于本发明。用于实施本发明一些方面的其它多核苷酸可以是单链、双链或嵌合单链或嵌合双链分子。具体实施例包括质粒DNA和反义寡核苷酸。
本文所用“取代”指有机官能团上的一个或多个悬垂的氢被取代基，优选被选自卤素、低级烷基或低级烷氧基、卤代甲基或卤代乙基所取代。
将本文所提及的所有出版物纳入本文作为参考，用于公开和描述本发明特征的目的，这就是引用这些出版物的目的。
组合物
在一个方面，本发明提供了含有小干扰核糖核酸(siRNA)和基于脂质偶联的聚酰胺的递送运载体的组合物。这些组合物在将siRNA递送给细胞时特别有用。
1. SiRNA
本发明组合物中掺入了有效地特异性抑制感兴趣基因的表达而不会诱导对正常细胞功能有害的任何其它活性，如干扰素反应的siRNA。有效siRNA通常(但不一定)是化学合成的。在具体实施方式
中，可采用含有具有两个核苷酸3’ -突出端和全部磷酸二酯连接的序列CAUA⑶GAG⑶UGCAUCUG⑶G (SEQ ID No 1)、针对Aktl信使RNA的siRNA。在一种情况下，这两个核苷酸3’ -突出端是TT(DNA)核苷酸。在另一种情况下，这两个核苷酸 3’ -突出端是0-甲基UU(RNA)核苷酸。
当转染入细胞时，如以下实施例1和3所述，这些siRNA显示能非常有效地降解内源性Aktl mRNA,导致相应的Aktl基因的活性消失。应理解，本文所述Aktl siRNA序列只是可与本发明组合物中的脂质-偶联的聚酰胺化合物递送运载体联用的许多其它可能的 siRNA序列的代表。
本领域技术人员从本文所提供的内容将会明白，其它siRNA序列可以相同或相似的易于确定的方式应用而取得对相应mRNA和基因的相同效果。
2.脂质-偶联的聚酰胺化合物
本发明提供掺入了以脂质-偶联的聚酰胺为基础的化合物的递送运载体的组合物。用于或用作这些递送运载体的合适的脂质偶联的聚酰胺偶联物见根据美国专利序列号 60/023，867,60/054, 743 和 09/132，808 的共同拥有的 PCT 公开 WO 98/06437 和 WO 99/08711 (Zuckermann等)；以及根据美国专利序列号60/151，246的共同拥有的PCT公开 WO 01/16306和美国专利序列号09/648,2 (Irmis等)中所述；以全文纳入本文作为参考用于所有目的。这些脂质偶联的聚酰胺偶联物具有以下通式
(I) Ra-[(NR1-W-CO) Jm-Rc
通式中η是1至约48的整数，m是约2至约48的整数，
通式中各单体单元-(NR1-W-CO)-的R1和Ra独立地选自氢原子；羟基；氨基；羧基；磺酰基；-SH ；含任选有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有1-8个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族基团，其中所述脂族基团任选地具有一个或多个双键或三键；在任选含有氮、 氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳基；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳烷基，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和任选地连接有接头部分的脂质部分，
通式中至少一个单体单元的R1不是氢原子，
通式中I 。选自氧原子；轻基；氨基；胼基；磺酰基；-SH ；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有1-8个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族基团，式中所述脂族基团任选地具有一个或多个双键或三键；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12 个碳原子的任选取代的芳基；在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳烷基，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和任选地连接有接头部分的脂质部分，
通式中当礼、Ra或R。是主链结构中碳原子少于5个的芳基或芳烷基时，所述主链结构还包含一个或多个氧和/或氮原子，
通式中各单体单元的W独立地选自含有碳且在任选含有氮、氧、硫和磷的主链中具有1至约50个原子和任选的一个或多个双键或三键的任选取代的、支链或直链二价部分，其中所述W的任选取代基可以是任选地连接有接头部分的脂质部分，
通式中所述脂质部分是疏水性或两性部分，选自
10[0105](i)在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有约14至约50个碳原子的任选取代的芳基或芳烷基部分，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和
(ii)在任选含有氮、氧、硫和磷的主链结构中具有约10至约50个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族部分，其中所述脂族部分任选地具有一个或多个双键或三键，和
通式中一个单体单元的民、I 。、W中至少-个和一个单体单元的R1包含脂质部分。
本发明的脂质偶联的聚酰胺可以是随机聚合物，其中R1和W各自从一种单体随机地变化为另一种单体(即η是l，m是约2至约48的整数)。或者，该脂质偶联的聚酰胺可以是具有m个η聚体(即η大于l，m是约2至约48的整数)的聚合物，或是重复(即各η 聚体相同)序列或随机变体(即各η聚体单体组成的随机单体组合物)。
整数η—般不大于约40，更常不大于约20，甚至更常不大于约6。η优选约3。整数m —般不大于约40更常不大于约25。通常，整数m不大于约15，一般不大于约12，甚至更常不大于约8。
当礼、艮和民是脂族时，它们的主链结构中一般含有至少2个碳原子，主链结构中更常含有至少约3个碳原子。芳基和芳烷基礼、民和民可以是线性或环状。主链结构中碳原子少于5个的芳基和芳烷基队、Ra和R。在主链结构中也可含有一个或多个杂原子，如氮和/或氧。芳基和芳烷基队、Ra和R。的主链结构中一般具有至少约5个碳原子。
Ra—般是-0H、-H、-SH、-C00H、磺酰基或任选地偶联有接头部分的脂质部分。Rc — 般是-0H、-H、-SH、-NH2、磺酰基、胼或任选地偶联有接头部分的脂质部分。Ra或R。优选为任选地偶联有接头部分的脂质部分。
R1在生理相关pH下可以是阳离子、阴离子或中性的侧链。生理pH —般为至少约 5. 5，一般至少约6.0。生理pH更常为至少约6. 5。通常，生理pH小于约8. 5，一般小于约 8.0。生理pH更常小于约7. 5。
合适的阳离子侧链包括例如氨基烷基(如氨基乙基、氨基丙基、氨基丁基等)及其衍生物；( -α -甲基乙烯二氨基及其衍生物；三甲基氨基乙基及其衍生物；胍基烷基 (如胍基乙基、胍基丙基、胍基丁基、胍基戊基等)及其衍生物；氨基苄基及其衍生物；吡啶及其衍生物；以及本领域普通技术人员已知的其它类似的阳离子部分。
合适的中性侧链包括例如( 或(R)-α -甲基苄基及其衍生物；苄基及其衍生物；苯乙基及其衍生物；萘甲基及其衍生物；( 或(R)-α-甲基萘基及其衍生物；N-丙基吡咯烷酮及其衍生物；环己基甲基及其衍生物；糠基及其衍生物；3，4，5_三甲氧基苄基及其衍生物；甲氧基乙基及其衍生物；对甲氧基苯乙基及其衍生物；异戊基(“IsoA”)及其衍生物；以及本领域普通技术人员已知的其它类似的中性部分。
合适的阴离子侧链包括例如羧甲基、羧乙基等及其衍生物；苯甲酸及其衍生物； 磷酸酯及其衍生物；硫酸酯及其衍生物；以及本领域普通技术人员已知的其它类似的阴离子部分。
任选地，R1可以是天然产生的或非天然产生氨基酸上发现的部分，或者札可以是任选地连接有接头部分的脂质部分。本文所用术语“天然产生的氨基酸”指Ala、Cys、Asp、 Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、kr、Thr、Val、Trp 和 Tyr)。术语“非天然产生的氨基酸”指一般在大自然中未发现的氨基酸，包括例如天然产生的氨基酸的D-异构体。[0117]R1 一般在至少两个单体单元中不是氢，更通常，如果ηXm是3或更大，R1在至少三个单体单元中不是氢。一般不到75%的单体单元的R1是氢。更通常，不到50%的单体单元的R1是氢。甚至更通常，不到25%的单体单元的R1是氢。甚至更通常，任何一种单体单元的R1都不是氢。
W 一般是-CH2CH2-、-CH2-C6H4-C ( = 0) O-(即甲苯酸)、-CH2CH2-O-、-CH2-CH = CH-或
(II)-CR2R3-
通式中各单体单元的民和民独立地选自氢原子；羟基；氨基；羧基；磺酰基；-SH ；在任选含有氮、氧、硫、磷等的主链结构中具有1-8个碳原子的任选取代的、支链或直链脂族基团，其中所述脂族基团任选地具有一个或多个双键或三键；在任选含有氮、氧、 硫、磷等的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳基；在任选含有氮、氧、硫、磷等的主链结构中具有3-12个碳原子的任选取代的芳烷基，其中所述芳烷基的烷基任选地具有一个或多个双键或三键；和任选地连接有接头部分的脂质部分，
其中当&或R3是主链结构中碳原子少于5个的芳基或芳烷基，所述主链结构还包含一个或多个氧和/或氮原子。
当&和R3是脂族时，它们的主链结构中一般含有至少2个碳原子，它们的主链结构中更常含有至少约3个碳原子。芳基和芳烷基&和R3基团可以是线性或环状。芳基和芳烷基&和R3的主链结构中的碳原子少于5个，其主链结构中也可含有一个或多个杂原子，如氮和/或氧。芳基和芳烷基民和R3的主链结构中一般至少含有约5个碳原子。
R2和民一般是天然产生的和非天然产生的氨基酸上发现的部分。通常，至少&和 R3之一是氢原子。最通常，在所有单体单元中&和民二者都是氢，故化合物(I)是脂质偶联的、N-取代的聚甘氨酸化合物。
在一个或多个单体中脂质部分可位于Ra、R。、队，或在一个或多个单体中位于W中的取代位置。脂质部分可直接连接于单体单元，或可通过接头部分间接连接于单体单元。
本文所用术语“接头”指一种部分，其作用为将低聚酰胺和脂质部分偶联在一起， 使脂质和低聚酰胺部分二者之间的分子距离大于直接互相偶联时的距离。接头部分可以相对较小，主链中含有1至约20个原子，或者是聚合体。小接头部分是任选取代的，一般其主链中含有1至约20个原子(如碳、氮、氧、硫、磷等)。小接头部分的主链中一般含有不到约18个原子，更通常，其主链中含有不到约15个原子。通常，小接头部分的主链中含有不到约10个原子，其主链中任选地含有不到约5个原子。
接头部分可衍生自能够与低聚反应物和脂质反应物反应的双功能分子如6-氨基己酸，2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酸等)。接头部分也可衍生自一些基因， 例如能促进脂质部分与低聚物部分偶联的在化学合成期间采用的基团如酰基和取代的酰基，磺酰基和取代的磺酰基等反应活性部分。
聚合接头部分是任选取代的(如羟基_、羧基_、磷_、氨基-等)、基本线性的聚合物，它的主链含有碳，和任选地含有氮、氧、硫、磷等。聚合接头部分的平均分子量约为300 道尔顿-15，000道尔顿，一般小于约10，000道尔顿，更常小于约5，000道尔顿，甚至更常小于约3000道尔顿，任选地小于约1000道尔顿。合适的聚合接头部分包括例如聚乙二醇、
聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等。
脂质部分是中性(即没有电荷或净电荷为零)或带电的、天然或合成产生的疏水
12部分或脂族部分。本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物的脂质部分一般为两性。
合适的脂质部分包括(1)在任选含有氮、氧、硫、磷等的主链结构中具有约14-50 个碳原子的任选芳基或芳烷基部分，其中芳烷基部分任选地具有一个或多个双键或三键; (2)在任选含有氮、氧、硫、磷等的主链结构中具有约10-50个碳原子的任选支链或直链脂族部分，并任选地具有一个或多个双键或三键。
芳基和芳烷基脂质部分一般含有至少约16个碳原子，更常含有至少约20个碳原子，甚至更常含有至少约30个碳原子。
用于本发明化合物的脂族脂质部分一般具有至少约12个碳原子，更常具有至少约14个碳原子。通常，脂族脂质部分具有至少约18个碳原子，更通常至少约M个碳原子， 甚至更通常至少约30个碳原子。
本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物中脂质部分的数量取决于所需疏水性程度而不同，也随低聚物长度(即nXm)和脂质部分大小而不同。例如，当脂质部分长约30个碳原子或更少时，本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物一般与其偶联，脂质部分少于单体基团总数(即nXm)的90% (即如果η是3、m是3，那么偶联于脂质-偶联的聚酰胺化合物的脂质部分的数量一般小于约8)。更通常，当脂质部分长约30个碳原子或更少时，本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物与其偶联，脂质部分少于单体基团总数的约80%，更常少于单体基团总数的约75%，甚至更常少于约单体基团总数的约60%。
当脂质部分长大于约30个碳原子时，本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物一般与其偶联，脂质部分少于单体基团总数的50%。
合适的脂质部分包括具有一个或多个疏水尾的脂质部分，所述疏水尾是任选取代的脂族直链部分，各自的主链中独立地长约8-30个碳原子，此外，主链中任选地含有氮、 氧、硫、磷等。疏水尾的主链中一般长至少约10个碳原子，其主链中更通常具有至少约12 个碳原子。用于本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物的疏水尾的主链一般不多于约26个碳原子，其主链更通常不多于约M个碳原子。
用于实施本发明的天然脂质部分可衍生自例如磷脂，包括例如磷酸甘油酯(包括磷酸甘油酰基酯(例如磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇磷酸酯、磷脂酰肌醇双磷酸酯、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油等)和醚磷酸甘油酯)；甘油糖基酯(例如二酰甘油、二半乳糖基二酰甘油、磺基奎诺糖基二酰甘油、二甘露糖基二酰甘油、 呋喃半乳糖基二酰甘油、半乳糖基葡糖基二酰甘油、半乳糖基葡糖基二酰甘油、葡糖基半乳糖基葡糖基二酰甘油等)；鞘脂(例如鞘氨醇、糖基神经节苷脂等)；饱和和不饱和的固醇 (例如胆固醇、麦角固醇、豆固醇、谷固醇等)；和其它类似的天然脂质。
合适的合成脂质部分可衍生自例如二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DMPE) (GenzymeCorp.，Cambridge)、DMRIE-C (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) ,2,3- 二油酰氧-N-[2 (精胺羧酰胺)乙基]-N，N- 二甲基-1-丙铵二氟乙酸(DOSPA) (Lipofectamine , GibcoBRL, Gaithersburg, MD) ,3 β-[N-(N', N，-二甲基氨基乙基)氨甲酰基]胆固醇、 Tfx-50 (Promega Corp.，Madison, WI), N, Ni, N2, N3-四甲基-N, Ni, N2, N3-四棕榈酰精胺 (TM-TPS) (Cellfectin，GibcoBRL, Gaithersburg, MD)、二棕榈酰磷脂酰乙醇氨基精胺等。
合适的脂质部分也包括衍生自有约8-M个碳原子的主链的脂肪酸和脂肪醇的脂质部分。脂肪酸和脂肪醇主链一般具有至少约10个碳原子，主链更通常至少约12个碳原
13子。通常，产生脂质部分的脂肪酸和脂肪醇的主链不到约20个碳原子。
Ra—般是脂质部分或偶联有接头部分的脂质部分。特别有用的含有脂质部分的Ra 基团是磷脂酰烷氨基-取代的酰基部分，具有下式，
(III) R4-CO-O-CH2CH (O-CO-R4) -CH2-O-PO3-- (CH2) p-NH2+_CH2-C0-
式中ρ是选自2或3的整数，R4各自独立地选自有约6-25个碳原子的主链的烷基或烯基部分。R4的主链一般含有多达约22个碳原子，更通常多达约20个碳原子，甚至更通常多达约18个碳原子。R4的主链一般含有至少约8个碳原子，更通常至少约10个碳原子， 甚至更通常至少约12个碳原子。示范性R4部分包括十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基等。P优选2。
可任选地将本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物进一步偶联于或复合于赋予其(例如)靶向能力、结构特征、生物学活性，或引入降解位点等的物质。合适的物质包括例如单糖、二糖和多糖、聚乙二醇、氨基酸、肽、多肽、蛋白质(包括例如脂蛋白、糖蛋白、抗体等)、 交联剂、标记物(如荧光素、生物素、32P等)等。
本领域普通技术人员将理解，不难改变R1Ac^RaJ和所采用的具体脂质部分，以优化脂质-偶联的聚酰胺化合物递送某具体类型多核苷酸的性能。例如，适合用于将siRNA 递送给细胞的本发明低聚部分带有正净电荷，能够凝缩多核酸，使其尺寸更加紧凑，因而有助于将其递送给细胞。
适合用于将siRNA递送给细胞的式(I)化合物包括具有重复的η聚体单元(即当 η大于1时)的脂质-偶联的聚酰胺化合物。例如，当η是3时，式⑴的脂质-偶联的聚酰胺化合物具有重复的3聚体单元，即
(IV) Ra- [ (NRi1-W1-CO)及其位置异构体，其中Ra、R。、m、各W和各R1的定义如式(I)。适用于将siRNA递送给细胞的具有式(IV)的化合物包括R11是阳离子侧链、礼2和R13都是中性侧链的化合物， 各W是CH2, Rc是NH2, Ra由式(III)定义。
本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物一般在溶液中形成浓度依赖性、有序的二维或三维结构。这种结构包括二维阵列如带电单层或脂质双层表面，和三维结构如微团、小泡和脂质体。有序结构一般可由本发明脂质-偶联的聚酰胺化合物本身形成，通常足够小以致它们不会散射光。由脂质偶联化合物与多核苷酸形成的复合物制备的微团、小泡和脂质体平均粒度一般小于约ι μ m,更通常小于约500nm，甚至更通常小于约200nm。
在具体实施方式
中，本发明的以脂质-偶联的聚酰胺化合物为基础的递送运载体可包括一种或多种下式的脂质-阳离子类肽偶联物
(VI) L-X- [N (CH2CH2NH2) CH2 (C = 0) -N(CH2CH2R) CH2 (C = 0)-N (CH2CH2R) CH2 (C = 0) I3-NH2
和其位置异构体
式中
L选自含有至少一个长约8-M个碳原子的脂族烷基或烯基链的非类固醇脂质部分，和固醇部分；
各基团R独立地选自烷基、氨基烷基和芳烷基，
X选自直接键连接、寡肽、长度为2至约30个键的基本线性的烷基链，和长度为2至约30个键由烷基键和选自酯键、酰胺键、碳酸酯键、氨基甲酸酯键、二硫键、肽键和醚键的一个或多个键连接组成的基本线性的链。
当L是非固醇脂质部分(即脂质部分不是或不含固醇基团如磷脂基团(即 R00CCH2CH(COOR) CH2OP (O)2O-)时，该脂质-阳离子聚酰胺偶联物在本文中称为“类脂”。当 L是固醇部分(即是或含有固醇基团如胆固醇基团的脂质部分)时，该脂质-阳离子聚酰胺偶联物在本文中称为“类胆固醇”。本发明组合物中的脂质-阳离子类肽偶联物可以是类脂、类胆固醇或(在一个重要实施方式中)其组合。
在具体实施方式
中，R是异丙基或4-甲氧基苯基。单个类脂或类胆固醇可包括不同基团R，或者它们在分子中可以相同。
这些运载体可通过常规的溶液或固相合成来制备，如上面引用的^ickermarm 等所述，并在下面进一步详述。在这种方法之一中，树脂-结合的类肽的N-末端有例如 Fmoc-氨基己酸或Fmoc- β -丙氨酸酰化的间隔物。去除Fmoc基团后，伯氨基与脂质部分如氯甲酸胆固醇酯反应形成氨基甲酸酯连接键，如图1的类胆固醇1和3所示。然后，用三氟乙酸从树脂上切下产物，用反相HPLC纯化。脂肪酸衍生的脂质部分，如磷脂可用于代替该类固醇部分，以形成本文所述的类脂，见图1。
脂质部分也可通过专业技术人员容易地获得的有效长度的其它连接键连接于聚酰胺如类肽部分。接头是长约30个键的链，更优选长约15个键，但可采用任何有效长度。 该链一般是线性或基本线性的，但也可采用间隔有环状基团的支链(包括寡肽)和接头。该接头通常包含烷基(C-C)键和一个或多个官能团，如酯键、酰胺键、碳酸酯键、氨基甲酸酯键、二硫键、肽键或醚键。该接头可包含多个官能团，如琥珀酸酯或聚醚中的官能团，或者可以是寡肽，优选2聚体 10聚体，更优选2聚体 5聚体。类固醇或脂质部分和类肽节段也可通过直接键相连接。
在某些实施方式中，接头中掺入了在体内合适条件下易受切割的一个或多个键； 例如，可水解的酯，碳酸酯，氨基甲酸酯，或肽键；二硫键，它们在具有充分还原的微环境的细胞区室中可被切断；以及肽键，它可被内源性肽酶切断。关于后者，考虑了具有十个或更少，或者(在其它实施方式中)五个或更少的肽键连接的多肽接头，但也可采用较长的接头。
此类接头的代表性结构见图1，给出以下名称
类脂1，或 Ll DMPE (NaeNmpeNmpe) 3
类脂2，或 L2 DMPE (NaeNiaNia)3
类脂3，或 L3 NtdNhd (NaeNmpeNmpe) 3
类脂4，或 L4 NddNol (NaeNmpeNmpe) 3
类胆固醇1，或 Cl Chol-β-ala-(NaeNmpeNmpe)3
类胆固醇3，或 C3 Chol-β-ala-(NaeNiaNia)3
其中“Ntd”是N-十四烷基甘氨酸；“Nhd”是N-十六烷基甘氨酸；“Ndd”是N-十二烷基甘氨酸；“Nol ”是N-油酰甘氨酸。
上面结构中出现的类肽单体如下
权利要求
1. 一种组合物，所述组合物包含在药学上可接受的递送运载体中的小干扰核糖核酸(siRNA)，所述递送运载体包含脂质-阳离子类肽偶联物及其位置异构体所述脂质-阳离子类肽偶联物选自以下化合物类胆固醇 1,或 Cl Chol-β-ala-(NaeNmpeNmpe)3类胆固醇 3，或 C3 Chol-β-ala-(NaeNiaNia)3或它们的组合。
2.如权利要求
1所述的组合物，其特征在于，所述脂质-阳离子类肽偶联物是类脂和类胆固醇的组合。
3.如权利要求
2所述的组合物，其特征在于，所述类脂类胆固醇比率约为5 1至 1 5。
4.如权利要求
3所述的组合物，其特征在于，所述类脂类胆固醇比率约为1 1至 1 3。
5.如权利要求
4所述的组合物，其特征在于，所述类脂是Li，所述类胆固醇是Cl。
6.如权利要求
4所述的组合物，其特征在于，所述类脂类胆固醇比率约为1 3。
7.如权利要求
1所述的组合物，其特征在于，所述运载体siRNA摩尔比约为 3. 75nmol IOOpmol0
8.如权利要求
1所述的组合物，其特征在于，所述siRNA是含有两个核苷酸3’突出端’ 和全部磷酸二酯键连接的21-23聚体RNA双链体。
9.如权利要求
8所述的组合物，其特征在于，所述siRNA包含SEQID NO=I代表的序列，含有两个核苷酸3’ -突出端和全部磷酸二酯键连接。
10.权利要求
1所述的组合物的用途，用于制备抑制对象中靶基因表达的药物。
11.如权利要求
10所述的用途，其特征在于，所述递送运载体是类脂和类胆固醇的组
12.如权利要求
11所述的用途，其特征在于，所述类脂类胆固醇比率约为5 1至 1 5。
13.如权利要求
12所述的用途，其特征在于，所述类脂类胆固醇比率约为1 1至 1 3。
14.如权利要求
13所述的用途，其特征在于，所述类脂是Li，所述类胆固醇是Cl。
15.如权利要求
10所述的用途，其特征在于，所述siRNA包含SEQID NO=I代表的序列，含有两个核苷酸3’ -突出端和全部磷酸二酯键连接。
16.如权利要求
10所述的用途，其特征在于，所述对象是哺乳动物细胞或细胞系。
17.如权利要求
10所述的用途，其特征在于，所述对象是哺乳动物。
18.如权利要求
17所述的用途，其特征在于，所述对象是人。
19.一种组合物，其包含类脂1，或Ll 类脂2，或L2 类脂3，或L3 类脂4，或L4DMPE(NaeNmpeNmpe)3 DMPE(NaeNiaNia)3NtdNhd(NaeNmpeNmpe) NddNol(NaeNmpeNmpe)至少两种脂质-阳离子类肽偶联物及其位置异构体的混合物，所述所述脂质-阳离子类肽偶联物选自以下化合物类胆固醇 1,或 Cl Chol-β-ala-(NaeNmpeNmpe)3 类胆固醇 3，或 C3 Chol-β-ala-(NaeNiaNia)3 或它们的组合，其中，第一种化合物是类脂，第二种化合物是类胆固醇。
20.如权利要求
19所述的组合物，其特征在于，所述组合物中第一种化合物与第二种化合物之比约为5 1至1 5。
21.如权利要求
20所述的组合物，其特征在于，所述组合物中第一种化合物与第二种化合物之比约为1 1至1 3。
22.如权利要求
21所述的组合物，其特征在于，所述组合物中第一种化合物与第二种化合物之比约为1 1。
23.如权利要求
22所述的组合物，其特征在于，所述组合物中第一种化合物与第二种化合物之比约为1 3。
24.如权利要求
19所述的组合物，其特征在于，所述组合物由Ll和Cl组成。类脂1，或Ll 类脂2，或L2 类脂3，或L3 类脂4，或L4DMPE(NaeNmpeNmpe)3 DMPE(NaeNiaNia)3NtdNhd(NaeNmpeNmpe) NddNol(NaeNmpeNmpe)
专利摘要
含有小干扰核糖核酸(siRNA)和将siRNA和其它多核苷酸递送给细胞特别有用的某些脂质偶联的聚酰胺化合物的递送运载体的组合物。以及该组合物的制备和使用方法。
文档编号C12N15/113GKCN1906308 B发布类型授权 专利申请号CN 200480040859
公开日2011年9月14日 申请日期2004年12月20日
发明者A·B·杰弗森, C·莱因哈德, R·N·楚克曼, T·S·伯克斯 申请人:诺华疫苗和诊断公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (1),