一种磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花及其制备方法和应用

本发明属于固定化酶，具体涉及一种磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花的制备方法和应用。

背景技术：

1、近几十年来，有机磷农药由于其优异的杀虫功效被广泛用于农业、林业和畜牧业中。有机磷化合物的多余和不合理的使用，对环境和食物链造成了巨大的危害。开发高效、环保的净化解决方案是一项长期挑战。处理有机磷污染物的方法包括碱水解、焚烧和填埋处理。然而这些方法效率低下，会产生有毒的副产品。生物酶法安全、高效、绿色环保、操作条件温和，显示出潜在的应用前景。目前酶法降解去除环境中的有机磷化合物越来越受到关注。然而，由于游离酶的生产成本高、稳定性低和可重用性差，实际应用受到限制。固定化酶可以提高酶的稳定性和重用性。目前已有多种支撑材料用于固定化有机磷水解酶，如尼龙，纤维素，碳纳米管，金属有机框架，和氧化石墨烯等。然而，这些固定化酶虽然提高了酶的稳定性，但是降低了酶的催化活性。2012年，戈钧的团队意外发现了以cu2+为无机成分，酶为有机组分通过自组装的形式会形成花状纳米复合材料。当一种酶被用作杂化纳米花的有机成分时，它表现出比游离酶更高的酶活性和稳定性。从那时起，包括漆酶、脂肪酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等在内的多种酶已被报道用于制备杂化纳米花，并显示出良好的催化能力。杂化纳米花的大比表面积、降低的传质限制以及纳米酶分子的协同作用被认为是其具有良好性能的原因。目前，各种酶类，还有dna，蛋白质和植物提取物作为有机组分用来合成杂化纳米花催化剂。但传统杂化纳米花的合成存在机械强度低、制备时间长、有效重复使用次数低、分离过程繁琐等缺点，在实际应用中需要解决。一般来说，酶-无机杂化纳米花的可重复使用性差与其机械强度较弱有关，杂化纳米花在使用或离心回收过程中花瓣结构容易破碎。

2、因此，如何亟需开发一种有效的合成方法来提高杂化纳米花体系的鲁棒性，同时保持高的催化活性和高效的回收性。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花的制备方法和应用。本发明所制备的磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花的催化活性高、机械强度好，具备高效的回收性。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

4、(1)制备磁性复合微球：将fe3o4分散于tris-hcl缓冲液中，得到磁粉悬液，再加入盐酸多巴胺和聚乙烯亚胺，经超声、振荡孵育后，得到磁性复合微球fe3o4-pda@pei；

5、(2)制备磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花：将磷酸三酯酶酶液加入磷酸盐缓冲溶液中，再加入cocl2溶液和磁性复合微球fe3o4-pda@pei进行孵育完成自组装，然后加入戊二醛溶液进行反应，得到磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花。

6、进一步地，步骤(1)中，所述tris-hcl缓冲液的浓度为10-50mmol/l，ph为7.0-10.0；所述tris-hcl缓冲液的用量为确保fe3o4的浓度为40-60g/l。

7、进一步地，步骤(1)中，所述盐酸多巴胺与fe3o4的质量比为1：5；所述聚乙烯亚胺与fe3o4的质量比为1：5。

8、进一步地，步骤(1)中，所述超声的功率为50-200w，时间为3-9min；所述振荡孵育的温度为20-35℃，转速为150-250rpm，时间为4-8h。

9、进一步地，步骤(2)中，所述磷酸三酯酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述磷酸三酯酶的比酶活为6.45u/mg；所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为10-40mmol/l，ph为7.0-10.0；所述磷酸三酯酶在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.1-0.15mg/ml；所述cocl2在磷酸盐缓冲液中的浓度为2-5mmol/l；所述磁性复合微球fe3o4-pda@pei在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.5-2g/l。

10、进一步地，步骤(2)中，所述超声孵育的温度为35-40℃，时间为2-12h。

11、进一步地，步骤(2)中，所述戊二醛在磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1-0.15％；所述反应的时间为0.5-2.5h。

12、一种所述制备方法制备的磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花。

13、一种所述磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花的应用，所述磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花用于降解有机磷农药。

14、进一步地，所述有机磷农药包括甲基对硫磷、杀螟磷、毒死蜱、乙硫磷。

15、本发明有益的技术效果在于：

16、本发明提供了一种磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花的制备方法，将多巴胺和聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米颗粒和磷酸三酯酶杂化纳米花结合，随后通过戊二醛交联，得到的磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花可以快速的和反应液分离，更好的重复利用，且具有更好的ph稳定性与温度稳定性。通过磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花的高比表面积，以及钴离子的激活作用，显著提升酶活性。

17、本发明进一步优化了磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花的制备条件，得到磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花最佳制备条件为：磷酸三酯酶浓度为0.1mg/ml，co2+浓度为2mmol/l，磁性复合微球的质量为0.5mg，孵育温度为37℃，戊二醛浓度为0.1％以及固定化时间为6h时，在最佳条件下制备的磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花的酶活能够达到游离酶的298％。

18、本发明制备的磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花在温度，ph和有机溶剂的稳定性都明显高于游离酶。室温储存30天，游离酶的活性基本消失，而磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花的相对活性为84.8％。此外，磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花在重复使用五次后仍能保持90.32％的相对活性。

19、本发明将磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花应用到甲基对硫磷，杀螟磷，毒死蜱和乙硫磷的降解实验中。当有机磷农药浓度为100mg/l，酶浓度0.02mg/ml，温度40℃，反应时间1h。磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花对四种有机磷农药的降解率分别为99％，96％，92％和85％，均明显高于游离酶。

技术特征：

1.一种磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述tris-hcl缓冲液的浓度为10-50mmol/l，ph为7.0-10.0；所述tris-hcl缓冲液的用量为确保fe3o4的浓度为40-60g/l。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述盐酸多巴胺与fe3o4的质量比为1：5；所述聚乙烯亚胺与fe3o4的质量比为1：5。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述超声的功率为50-200w，时间为3-9min；所述振荡孵育的温度为20-35℃，转速为150-250rpm，时间为4-8h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述磷酸三酯酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述磷酸三酯酶的比酶活为6.45u/mg；所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为10-40mmol/l，ph为7.0-10.0；所述磷酸三酯酶在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.1-0.15mg/ml；所述cocl2在磷酸盐缓冲液中的浓度为2-5mmol/l；所述磁性复合微球fe3o4-pda@pei在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.5-2g/l。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述超声孵育的温度为35-40℃，时间为2-12h。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述戊二醛在磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.1-0.15％；所述反应的时间为0.5-2.5h。

8.一种权利要求1-7任一项所述制备方法制备的磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花。

9.一种权利要求8所述磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花的应用，其特征在于，所述磷酸三酯酶-交联磁性杂化纳米花用于降解有机磷农药。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述有机磷农药包括甲基对硫磷、杀螟磷、毒死蜱、乙硫磷。

技术总结
本发明公开了一种磷酸三酯酶‑交联磁性杂化纳米花及其制备方法和应用。本发明中磷酸三酯酶‑交联磁性杂化纳米花的制备方法是将磷酸三酯酶加入到磷酸盐缓冲溶液中，然后加入CoCl<subgt;2</subgt;溶液和合成的磁性复合微球Fe<subgt;3</subgt;O<subgt;4</subgt;‑PDA@PEI，放置在一定温度下孵育，随后添加戊二醛进行反应，得到磷酸三酯酶‑交联磁性杂化纳米花。本发明所制备的磷酸三酯酶‑交联磁性杂化纳米花的活性较高，对甲基对硫磷、杀螟磷、毒死蜱和乙硫磷具有优异的降解性能，并且回收方便，具有良好的酸碱稳定性、温度稳定性和储藏稳定性，重复使用仍具备较高活性。本发明所制备的磷酸三酯酶‑交联磁性杂化纳米花的催化活性高、机械强度好，具备高效的回收性。

技术研发人员：张梁,陈剑雄,辛瑜,郝梦瑶,顾正华,郭自涛,朱瑞
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/12/19