转基因工程番茄果实中虾青素的超临界二氧化碳流体萃取方法与流程

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种转基因工程番茄果实中虾青素的超临界二氧化碳流体萃取方法，同时还提供转基因工程番茄果实中类胡萝卜素的超临界二氧化碳流体萃取方法。

背景技术：
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虾青素是自然界中抗氧化活性最强的生物活性物质，随着植物基因工程技术的发展，以植物尤其是经济作物作为生物反应器生产虾青素已成为国内外研究的热点，虾青素是分子结构独特的酮式类胡萝卜素，是自然界中抗氧化活性最强的生物活性物质，具有抗辐射、抗衰老、抗肿瘤和预防心血管等疾病的功效，已应用于化妆品、保健品和水产养殖等方面。商业化的天然虾青素主要来源于雨生红球藻，该藻为光合自养绿藻，对环境敏感、生长慢、难以实现高密度的细胞生长，这是目前国内外无法突破其产量瓶颈以及虾青素价格昂贵的主要原因。植物因缺乏类胡萝卜素酮化酶(bkt)而不合成虾青素，表达外源的bkt可能使植物尤其是经济作物成为高效的虾青素生产工厂。黄俊潮等通过基因工程技术将绿藻中筛选和分离到能催化植物细胞中β-胡萝卜素和玉米黄素成虾青素的酮化酶和羟化酶基因转入野生型番茄植株中，首次获得了一种富含虾青素的转基因工程番茄，其成熟果实中虾青素的含量高达16.1mg/g,克服了植物难以积累高含量虾青素的难题，以此种转基因工程番茄作为生物反应器生产虾青素具有极大的商业前景。

虾青素对光、温比较敏感，在提取加工过程中,光、热、氧等很多因素可促进或加速虾青素发生降解；且传统的有机溶剂提取法因残留物无法完全去除，而对人体造成伤害，破坏机体免疫系统,引起癌症等疾病的发生。超临界二氧化碳流体萃取是一种新型的萃取技术，具有萃取和分离的双重作用，萃取过程物料无相变因而节能明显，且工艺流程简单，萃取效率高，无有机溶剂残留，产品质量好，无环境污染。本文对超临界二氧化碳流体萃取技术从虾青素工程番茄中提取虾青素的工艺做了初步的探讨，同时对提取物中具有高利用价值的番茄红素、β胡萝卜素做了分析，为利用转基因工程番茄产业化生产虾青素奠定了技术基础。目前，现有技术中未见有利用超临界二氧化碳流体萃取技术从转基因工程番茄中提取虾青素的方法的报道。也没有转基因工程番茄果实中类胡萝卜素的超临界二氧化碳流体萃取方法的报道。

技术实现要素：
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本发明的目的在于针对现有技术存在的不足之处，提供一种利用超临界二氧化碳流体萃取技术从转基因工程番茄中提取虾青素的方法，同时提供从转基因工程番茄果实中类胡萝卜素的超临界二氧化碳流体萃取方法。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

转基因工程番茄果实中虾青素的超临界二氧化碳流体萃取方法，该方法包括取预先过筛的虾青素工程番茄果实干粉,调节系统温度和压力至设定值,待萃取釜的温度及压力达到设定值且稳定后，进行1h的静态萃取；静态萃取结束后打开平流泵，以1.0g/min将夹带剂输送到到设备中去，夹带剂与二氧化碳气体的混合流体进入萃取釜，开始动态萃取，然后进行皂化。

如所述的转基因工程番茄果实中虾青素的超临界二氧化碳流体萃取方法，该方法进一步采用皂化手段将虾青素酯全部转化为游离态虾青素，将虾青素工程番茄的萃取液进行皂化，取1ml提取液，利用浓缩仪浓缩干，溶于1ml乙醚，加入1mlkohmeoh混匀，0℃黑暗环境中反应15min，加入2ml10％nacl混匀，2000g离心2min，移除水相，用2ml10％nacl洗两遍，溶于1ml丙酮溶液，抽滤后上样测定色素含量。

如所述的转基因工程番茄果实中虾青素的超临界二氧化碳流体萃取方法，取预先过筛的番茄果实干粉,调节系统温度至50℃，萃取压力35mpa,待萃取釜的温度及压力达到设定值且稳定后，进行1h的静态萃取；静态萃取结束后打开平流泵，将无水乙醇输送到到设备中去，无水乙醇与二氧化碳气体的混合流体进入萃取釜，开始动态萃取，动态萃取时间为2h。

转基因工程番茄果实中的类胡萝卜素超临界二氧化碳流体萃取方法，该方法包括取预先过筛的番茄果实干粉,调节系统温度至50℃，萃取压力35mpa,待萃取釜的温度及压力达到设定值且稳定后，进行1h的静态萃取；静态萃取结束后打开平流泵，将无水乙醇输送到到设备中去，无水乙醇与二氧化碳气体的混合流体进入萃取釜，开始动态萃取，动态萃取时间为2h。

如所述的转基因工程番茄果实中的类胡萝卜素超临界二氧化碳流体萃取方法，该方法进一步对类胡萝卜素含量进行定量测定，所述的类胡萝卜素为虾青素、番茄红素、β胡萝卜素，其定量测定方法采用：准确称取虾青素、番茄红素、β胡萝卜素标准品各5mg混合后用丙酮溶解并定容至100ml，取1ml，5ml，10ml混合溶解液用丙酮分别定容至50ml，制成1ug/ml，5ug/ml,10ug/ml标准品混合样，利用uplc上样制作标准曲线，计算虾青素、番茄红素、β胡萝卜素的含量，所述的uplc方法为：流速：1ml/min；进样量：5ul；0-1.0min：水：20％，乙腈：60％，异丙醇：5％，甲醇：15％；1.00-2.00min：水：0％，乙腈：80％，异丙醇：5％，甲醇：15％；2.00-8.00min：水：0％，乙腈：80％，异丙醇：5％，甲醇：15％；

转基因工程番茄果实中番茄红素的超临界二氧化碳流体萃取方法，该方法包括取预先过筛的番茄果实干粉,调节系统温度至50℃，萃取压力35mpa,待萃取釜的温度及压力达到设定值且稳定后，进行1h的静态萃取；静态萃取结束后打开平流泵，将无水乙醇输送到到设备中去，无水乙醇与二氧化碳气体的混合流体进入萃取釜，开始动态萃取，动态萃取时间为2h。

转基因工程番茄果实中β胡萝卜素的超临界二氧化碳流体萃取方法，该方法包括取预先过筛的番茄果实干粉,调节系统温度至50℃，萃取压力

35mpa,待萃取釜的温度及压力达到设定值且稳定后，进行1h的静态萃取；静态萃取结束后打开平流泵，将无水乙醇输送到到设备中去，无水乙醇与二氧化碳气体的混合流体进入萃取釜，开始动态萃取，动态萃取时间为2h。

本发明是利用超临界二氧化碳流体萃取技术从转基因工程番茄中提取虾青素。在发明中，萃取温度50℃，萃取压力35mpa，萃取2h的情况下，虾青素的提取率可达95％，此方法用料安全，提取率高，非常适合转基因工程番茄虾青素的提取。此外，转基因工程番茄中含有高营养价值的番茄红素及β胡萝卜素等类胡萝卜素，在虾青素的最佳提取条件下，番茄红素提取率为82％，β胡萝卜素提取率为89％。本研究为转基因工程番茄产业化提取虾青素奠定了技术基础。

附图说明：

图1不同夹带剂对虾青素提取率的影响；

图2萃取温度对虾青素提取率的影响；

图3萃取压力对虾青素提取率的影响；

图4萃取时间对虾青素提取率的影响；

图5转基因工程番茄果实类胡萝卜素色谱图。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

实施例1：

材料和方法

材料和设备：

无水乙醇,75％乙醇，乙酸乙酯，丙酮，正己烷均为国产分析纯；异丙醇、乙腈、甲醇为德国fisher色谱纯；超临界二氧化碳流体萃取装置,美国waters(tharsfe)；超高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司，1290infinity；色谱柱，美国安捷伦科技有限公司，eclipseplusc18rrhd1.8μm；旋转蒸发仪,东京理化，eyelen-1100；分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司，tp-213。

番茄果实干粉：虾青素工程番茄(黄俊潮等(huangjc等，2013)通过基因工程方法将绿藻中筛选和分离到能催化植物细胞中β-胡萝卜素和玉米黄素成虾青素的酮化酶和羟化酶基因转入野生型番茄植株(cv.uc82b)中，得到的转基因番茄(已于2014年5月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：cgmccno9223号，分类命名：虾红1号转基因番茄。)f4番茄干粉，过筛200目。

方法：

超临界二氧化碳流体萃取方法：每次取预先过筛的虾青素工程番茄果实干粉200g,调节系统温度和压力至设定值,待萃取釜的温度及压力达到设定值且稳定后，进行1h的静态萃取；静态萃取结束后打开平流泵，以1.0g/min将夹带剂输送到到设备中去，夹带剂与二氧化碳气体的混合流体进入萃取釜，开始动态萃取。本研究将对萃取压力、萃取温度、夹带剂、萃取时间进行考察，根据虾青素的提取率确定最佳萃取条件，在考察一个参数时，设定其他参数不变。

虾青素皂化方法：虾青素在转基因番茄果实中一部分是以虾青素酯的形式存在，因此需要采用皂化手段将虾青素酯全部转化为游离态虾青素。具体方法是：取1ml超临界二氧化碳流体萃取方法所得虾青素萃取液，利用浓缩仪浓缩干，溶于1ml乙醚，加入1mlkohmeoh混匀，0℃黑暗环境中反应15min，加入2ml10％nacl混匀，2000g离心2min，移除水相，用2ml10％nacl洗两遍，溶于1ml丙酮溶液，抽滤后上样测定色素含量。

虾青素、番茄红素、β胡萝卜素的定量方法如下：准确称取虾青素、番茄红素、β胡萝卜素标准品各5mg混合后用丙酮溶解并定容至100ml，取1ml，5ml，10ml混合溶解液用丙酮分别定容至50ml，制成1ug/ml，5ug/ml,10ug/ml标准品混合样，利用uplc上样制作标准曲线，计算虾青素、番茄红素、β胡萝卜素的含量。uplc方法：流速：1ml/min；进样量：5ul；0-1.0min：水：20％，乙腈：60％，异丙醇：5％，甲醇：15％；1.00-2.00min：水：0％，乙腈：80％，异丙醇：5％，甲醇：15％；2.00-8.00min：水：0％，乙腈：80％，异丙醇：5％，甲醇：15％；

结果与分析

不同夹带剂对虾青素提取率的影响：

在超临界二氧化碳流体萃取过程中，考察夹带剂的影响时，选定其他参数为：萃取温度35℃，萃取压力35mpa，萃取时间3h。分别用50％乙醇，75％乙醇、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯作为夹带剂进行试验。测定虾青素提取率，结果如图1。

由图1可以看出，用无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯作为夹带剂时，虾青素提取率均较高。这说明，在超临界状态下，二氧化碳流体的极性非常小，而夹带剂的加入，特别是高极性的夹带剂，有利于虾青素溶解于超临界二氧化碳流体中。但丙酮、乙酸乙酯是有机溶剂，残留难以完全去除，而无水乙醇不但安全，而且成本低，提取率相对较高，因此可以选择无水乙醇作为最佳夹带剂。

萃取温度对虾青素提取率的影响：

在超临界二氧化碳流体萃取过程中，考察温度的影响时，选定其他参数为：萃取压力35mpa，萃取时间3h，夹带剂无水乙醇，在此实验条件设定温度30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃。测定虾青素提取率，结果如图2。

由图2可以看出，虾青素的提取率随温度的升高而升高，温度为50℃时达到最大，之后，提取率随温度的升高而降低。这可能由于，当温度升高，蒸气压增大，使虾青素在超临界二氧化碳流体中的溶解度增大，但当温度继续升高时由于游离态虾青素在高温环境下容易受热分解从而导致提取率降低。因此，超临界二氧化碳流体萃取虾青素的最佳温度为50℃。

萃取压力对虾青素提取率的影响：

在超临界二氧化碳流体萃取过程中，考察压力的影响时，选定其他实验参数为：温度50℃，夹带剂无水乙醇，萃取时间3h，，在此实验条件设定压力10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃。测定虾青素提取率，结果如图3。

由图3可以看出，虾青素的提取率随着萃取压力的增高而增加，压力35mpa时，提取率为90％，压力40mpa时，提取率为92％。这说明当压力增高，流体密度增加，引起萃取物在超临界二氧化碳流体中的溶解度提高，致使萃取虾青素提取率增加。虽然压力越高，越有利于提取率的提高，但由于实验设备限制，并且在生产应用中，压力的过高会导致设备寿命降低，增加运营成本，因此采用35mpa为最佳萃取压力。

萃取时间对虾青素提取率的影响：

在超临界二氧化碳流体萃取过程中，考察萃取时间的影响时，选定其他实验参数为：萃取温度50℃，萃取压力35mpa，夹带剂为无水乙醇；分别萃取1.0h，1.5h，2.0h，2.5h，3.0h，3.5h，4.0h。测定虾青素提取率，结果如图4。

由图4可以看出，虾青素的提取率随着萃取时间的增加而增加，2.5h时提取率达到最大，在4h时提取率急剧下降，这可能是由于热敏性的虾青素在长时间处于萃取温度50℃，35mpa的条件下，虾青素受热分解造成的。因此2.5h为最佳萃取时间。

番茄果实中类胡萝卜素含量比较分析：

在超临界二氧化碳流体萃取过程中，在考察果实中类胡萝卜素含量及提取率时，设定实验参数为虾青素的最佳提取条件：萃取温度50℃，萃取压力35mpa，无水乙醇萃取2h，分别计算虾青素、番茄红素、β胡萝卜素的含量及提取率。

从图5、表1可以看出，转基因工程番茄果实中不仅含有虾青素，还有番茄红素及β胡萝卜素。虾青素的提取率为95％，含量为1.90mg/g干重，番茄红素提取率为82％，含量为0.74mg/g干重，β胡萝卜素的提取率为89％，含量为0.85mg/g干重。

表1转基因工程番茄果实类胡萝卜素含量

本发明的最佳技术方案：

取预先过筛的番茄果实干粉200g,调节系统温度至50℃，萃取压力35mpa,待萃取釜的温度及压力达到设定值且稳定后，进行1h的静态萃取；静态萃取结束后打开平流泵，将无水乙醇输送到到设备中去，无水乙醇与二氧化碳气体的混合流体进入萃取釜，开始动态萃取，动态萃取时间为2h，虾青素的提取率为95％。在此萃取条件下萃取虾青素的同时，本发明同时还得到高价值的番茄红素、β胡萝卜素，其提取率分别为82％和89％。