一种磁分离RCA合成DNA酶检测金黄色葡萄球菌的方法与流程

本发明涉及一种磁分离rca合成dna酶检测金黄色葡萄球菌的方法，属于食品安全技术领域。

背景技术：

金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)大量存在于自然界中，是一种典型的球型革兰氏阳性菌。金葡菌对生长环境要求不严，肉类、鱼类、乳制品等绝大多数食品都可为其提供良好的生长条件，在适宜的温度下，可产生耐高温的肠毒素从而引发食物中毒。我国每年发生大量由金葡菌引起的食物中毒事件，其主要表现症状为呕吐和腹泻。因此，对金葡菌作出快速、精确的检测十分重要。

传统检测金葡菌的方法为根据国标法对其进行分离培养和生化鉴别，存在检测耗时、操作繁琐、检测限高等缺点，无法达到现今食品中微生物安全性的要求。随着生物技术的快速发展，许多新型快速检测技术得到了广泛的研究和应用，如pcr技术、免疫学技术、生物传感器和基因芯片技术等。

滚环扩增技术(rollingcircleamplification，rca)是近几年发展起来的一种等温条件下的dna复制技术，以短寡核苷酸链为引物，线性单链dna序列形成环状模板，运用具有链置换作用的dna聚合酶使引物生成包含若干串联重复序列互补环状模板的线性长链dna分子。rca具有操作简单、高特异性、扩增效率高、产物稳定等优点。dna酶是一段能形成g-四链体的核苷酸序列结合氯化血红素后模拟过氧化物酶功能的复合物，可催化h2o2与鲁米诺的化学发光反应。滚环扩增合成dna酶，结合了滚环扩增的信号放大作用和dna酶的催化作用，双重放大。

近年来，许多研究将dna夹心杂交原理结合纳米材料应用于致病菌的检测，但其中也存在着一些检测限高、灵敏度低和操作复杂等问题。因此，有必要建立一种检测限低、灵敏度高且操作简单的检测金黄色葡萄球菌的方法。

技术实现要素：

为了解决目前存在的金黄色葡萄球菌检测限高等问题，本发明提供了一种磁分离滚环扩增合成dna酶检测金黄色葡萄球菌的方法。本发明方法，将金黄色葡萄球菌的16srdna为一段特异性检测的目标dna片段，使用特异性探针修饰的磁纳米粒子来结合和分离金葡菌的16srdna，不仅利用磁纳米粒子的磁性分离作用，还利用探针和金葡菌16srdna间特异性的互补配对作用，从而快速地从复杂组分中分离金葡菌16srdna，并有效结合滚环扩增技术合成的dna酶催化h2o2-鲁米诺反应系统来实现信号的双重放大和检测。

本发明利用dna夹心杂交原理设计了两条特异性的探针——捕获探针和信号探针。将捕获探针修饰到磁纳米粒子表面，该材料可快速地从复杂组分中结合和分离金黄色葡萄球菌的目标dna序列，再加入包含滚环扩增引物的信号探针与目标dna序列互补杂交形成夹心结构，然后滚环扩增引物与相应包含dna酶互补序列的模板互补配对引发滚环扩增反应合成dna酶，利用dna酶进行催化h2o2-鲁米诺化学发光反应系统，根据相对发光值的变化来定量检测金葡菌。在一定范围内，金黄色葡萄球菌的浓度与相对发光值的变化呈线性相关，可达到对金黄色葡萄球菌定量检测的目的。

本发明方法，包括如下步骤：

(5)先将捕获探针与亲和素修饰的磁纳米粒子(avidin-mnps)混匀、孵育，使捕获探针修饰到磁纳米粒子表面，得到捕获探针功能化的磁纳米粒子；所述捕获探针功能化的磁纳米粒子能够结合金黄色葡萄球菌的目标dna序列；

(6)将捕获探针功能化的磁纳米粒子与含目标dna序列的待测液孵育，然后加入信号探针，使目标dna序列与捕获探针、信号探针生成夹心结构；所述信号探针上包含滚环扩增引物；

(7)加入滚环扩增模板，然后滚环扩增引物与相应包含dna酶互补序列的模板互补配对引发滚环扩增反应合成dna酶；

(8)利用dna酶进行催化h2o2-鲁米诺化学发光反应系统，根据相对发光值的变化来定量检测金黄色葡萄球菌。

在一种实施方式中，所述方法还包括先配制一定含有不同浓度的目标dna序列的标准样品，建立不同浓度的目标dna序列与相对发光值的标准曲线，当检测待测样品时，将利用待测样品得到的相对发光值代入到标准曲线中，即得到待测样品中的目标dna序列的浓度。

在一种实施方式中，所述目标dna序列为cctttgacaactctagagatagagccttc(如seqidno:1所示)。

在一种实施方式中，所述金黄色葡萄球菌是来源于食品中的金黄色葡萄球菌。

在一种实施方式中，所述含目标dna序列的待测液，是提取食品中的金黄色葡萄球菌基因组得到的。

在一种实施方式中，所述捕获探针的序列(如seqidno:2所示)为：biotin-ttttttgaaggctctatctct。

在一种实施方式中，所述信号探针的序列为(如seqidno:3所示)：agagttgtcaaaggttttttaggatcgtgtggtt。

在一种实施方式中，所述dna酶的序列为：tggctgagttttgggttgggcgggttgggt(如seqidno:5所示)。

在一种实施方式中，所述相应包含dna酶互补序列的模板序列为(5’-3’)：accgactcaaaacccaacccgccctacccaaaacccaacccgccctacccaaacatacacacagca(如seqidno:4所示)。

在一种实施方式中，所述亲和素修饰的磁纳米粒子的制备方法是：使用戊二醛交联法，将氨基化的磁纳米粒子加入到戊二醛和pbs溶液中，混合均匀后室温下避光反应2h，用pbs缓冲液清洗3次后，再加入亲和素溶液震荡避光反应6h，pbs缓冲液清洗3次，即获得亲和素修饰的磁纳米粒子。

在一种实施方式中，所述步骤(3)的滚环扩增反应包括连接反应和rca过程；连接反应具体是：加入滚环扩增模板，孵育一段时间使模板两端与信号探针中的引物序列互补配对，然后加入t4dna连接酶连接反应一段时间使模板两端连接成环，再使酶失活；rca过程具体是：加入phi29dna聚合酶进行滚环扩增反应，反应一段时间后，使酶失活。

在一种实施方式中，所述检测的过程为：取滚环扩增产物、hepes缓冲液和氯化血红素混匀，室温孵育1h来形成dna酶。在96孔板中加入h2o2母液、鲁米诺母液、dna酶和反应缓冲液，混和均匀，用多功能酶标仪检测相对发光值，根据相对发光值变化对金黄色葡萄球菌进行定量检测。

在一种实施方式中，所述磁纳米粒子的浓度为0.8～1.2mg/ml。

在一种实施方式中，所述捕获探针的的浓度为80～160nmol/l。

在一种实施方式中，所述连接反应的时间为40～60min。

在一种实施方式中，所述rca过程中滚环扩增反应的时间为40～60min。

在一种实施方式中，所述方法的具体步骤为：

(1)制备捕获探针功能化的磁纳米粒子

将氨基化磁纳米粒子加入到戊二醛和pbs溶液中混匀，避光反应，再加入亲和素溶液避光反应，获得亲和素修饰的磁纳米粒子；再取合成的亲和素修饰的磁纳米粒子和捕获探针混匀，室温条件下孵育、清洗，获得捕获探针功能化的磁纳米粒子；

(2)目标dna序列与探针生成夹心结构

取捕获探针功能化的磁纳米粒子，加入含目标dna序列的待测液，室温后孵，再加入信号探针，室温孵育生成夹心结构，清洗，加水补至10μl；

(3)滚环扩增反应

在步骤(2)制备的混合液中加入12.5μl滚环扩增模板，混匀后孵育，使模板两端与信号探针中的引物序列互补配对，然后加入t4dna连接酶缓冲液和适量的t4dna连接酶，反应一段时间，使模板两端连接成环，再于一定条件下孵育使酶失活；清洗后，加入phi29dna聚合酶缓冲液、bsa、dntps、适量phi29dna聚合酶和超纯水混匀后，一定条件下进行滚环扩增反应一段时间，并于一定条件孵育使phi29dna聚合酶失活；

(4)滚环扩增产物的化学发光检测

取扩增产物、hepes缓冲液、氯化血红素母液和超纯水混匀，室温下孵育形成dna酶。在黑色96孔板中加入h2o2母液、鲁米诺母液、dna酶和反应缓冲液，混和均匀，用多功能酶标仪检测化学发光反应的相对发光值，根据相对发光值变化对金葡菌进行定量检测。

本发明的优点和效果：

(1)本发明利用夹心杂交原理和磁分离作用，探针修饰的磁纳米粒子特异性识别和分离金黄色葡萄球菌的16srdna序列，提高了检测的准确性和特异性。

(2)本发明结合滚环扩增信号放大作用和dna酶的催化作用，双重放大，提高了检测方法的灵敏度。

(3)对金黄色葡萄球菌的检测限较低，达到4.2×10¹cfu/ml。

附图说明

图1为本发明的金黄色葡萄球菌检测原理示意图。

图2为sybrgreeni荧光验证dna序列杂交夹心原理图。

图3为不同浓度金黄色葡萄球菌与相对发光值的关系曲线。

图4为tdna检测的特异性分析。

图5为金黄色葡萄球菌检测的特异性分析。

具体实施方案

如图1所示，为本发明的金黄色葡萄球菌检测原理示意图。

利用磁纳米分离技术、滚环扩增技术与dna酶技术，构建了基于磁分离滚环扩增合成dna酶检测金葡菌。

本发明方法：设计两条不同的dna探针和目标dna(即tdna，如seqidno:1所示)可生成夹心结构，其中probe1为捕获探针(序列为：biotin-ttttttgaaggctctatctct，如seqidno:2所示)，可经生物素-亲和素的特异性作用修饰到磁纳米粒子上来进行分离；而probe2为信号探针(序列为：agagttgtcaaaggttttttaggatcgtgtggtt，如seqidno:3所示)，包含有引发rca的引物序列可与设计的线性rca模板(序列如seqidno:4所示)互补配对，然后开始rca反应，产生与环状模板互补的长单链扩增产物。扩增产物结合hemin形成dna酶(序列如seqidno:5所示)，可催化h2o2-鲁米诺反应系统发生化学发光反应。

如图2所示，为本发明方法原理的验证。捕获探针功能化的磁纳米粒子probe1-mnps可用于捕获tdna，然后再连接包含rca引物的probe2。在tdna的存在下，probe1和tdna间互补配对形成双链结构，可以使荧光染料sybrgreeni嵌入，并通过荧光分光光度计检测到较强的荧光信号。相比之下，若没有加入tdna则反应体系中无双链结构形成，故加入荧光染料sybrgreeni后只能检测到微弱的荧光信号。当再加入probe2进一步孵育后，形成probe1/tdna/probe2双链夹心结构，则加入荧光染料sybrgreeni后可检测到更强的荧光信号，表明probe2成功连接到磁纳米粒子上。此外，若加入完全错配的mdna4，则也没有观察到显著的荧光信号，证明只有tdna存在下才能特异性形成夹心结构。

此外，加入10nmol/ltdna的实验组与未加tdna的空白组经rca反应后经多功能酶标仪m5所检测到的相对发光值，可以清楚看出，实验组的相对发光值远大于空白组，表明只有在tdna存在下，mnps才能修饰上双链夹心结构，并且probe2才能进行后续的rca反应，使得实验组生成大量的dna酶来催化h2o2-鲁米诺反应系统产生强烈的化学发光反应。而当不存在tdna情况下，probe2不能修饰到mnps上，无法进行后续的rca反应和dna酶生成，h2o2-鲁米诺反应系统在mnps的催化作用下进行微弱的化学发光反应，只能形成微弱的相对发光值。将实验组相对发光值减去空白组得到实际相对发光值，且后续实验中发现实际相对发光值和tdna浓度呈一定线性关系。由此进一步表明，建立的双链夹心结构结合mnps分离技术的特异性强，并利用rca技术和dna酶技术来放大信号，可以用于金葡菌的快速检测。

下面是对本发明进行具体描述。

实施例1

(1)制备捕获探针功能化的磁纳米粒子

500μl氨基化磁纳米粒子加入到150μ戊二醛和1350μlpbs溶液中混匀，避光反应2h，用pbs缓冲液清洗3次，再加入500μl一定浓度的亲和素震荡避光反应6h，pbs缓冲液清洗3次，获得亲和素修饰的磁纳米粒子。再取240μl合成的亲和素修饰的磁纳米粒子和10μl捕获探针混匀，室温条件下孵育30min，用te缓冲液清洗3次后，获得捕获探针功能化的磁纳米粒子。

(2)16srdna序列与探针生成夹心结构

取30μl捕获探针功能化的磁纳米粒子，加入含16srdna序列(即含目标dna)的待测液，室温后孵育30min，用te缓冲液清洗3次，再加入3μl信号探针，室温孵育30min生成夹心结构，用te缓冲液清洗3次后，加超纯水补至10μl。

(3)滚环扩增反应

在上述制备的混合液中加入12.5μl滚环扩增模板，混匀后在37℃条件下孵育30min，使模板两端与信号探针中的引物序列互补配对，然后加入2.5μl10×t4dna连接酶缓冲液和适量的t4dna连接酶，37℃反应1h，使模板两端连接成环，再于65℃条件下孵育10min使酶失活。用te缓冲液清洗3次，加入5μl10×phi29dna聚合酶缓冲液、2μlbsa、2μldntps、适量phi29dna聚合酶和20.5μl超纯水混匀后，30℃条件下进行滚环扩增反应1h，并于65℃孵育10min使聚合酶失活。

(4)滚环扩增产物的化学发光检测

取50μl扩增产物、100μlhepes缓冲液、0.2μl氯化血红素母液和50μl超纯水混匀，室温下孵育1h形成dna酶，再将dna酶稀释10²倍。在黑色96孔板中加入10μlh2o2母液、10μl鲁米诺母液、10μldna酶和170μl反应缓冲液，混和均匀，用多功能酶标仪检测化学发光反应的相对发光值，根据相对发光值变化对金黄色葡萄球菌进行定量检测。

(5)对金黄色葡萄球菌检测的反应条件优化。优化结果为：磁纳米粒子浓度为1.0mg/ml，捕获探针浓度为100nmol/l，扩增时间为50min，连接时间为50min。

(6)金黄色葡萄球菌标准检测曲线的建立。取500μl不同浓度的金黄色葡萄球菌菌悬液用煮沸法提取dna，再采用本方法进行定量检测。实验结果为：在最优条件下，金黄色葡萄球菌浓度在5.5×10¹～5.5×10⁶cfu/ml范围内与相对发光值呈线性正相关(如图3所示)，r²＝0.991，检测限为4.2×10¹cfu/ml。

(7)人工污染实际样品中金黄色葡萄球菌的检测：将自来水、桶装水和牛奶样品经过紫外照射杀菌后，把不同浓度的金黄色葡萄球菌菌悬液加入其中并混匀。取500μl各样品用水煮法提取金黄色葡萄球菌的dna，再采用本方法进行化学发光检测，从标准曲线中求得对应的实际样品中可被检测到的金葡菌菌落数，同时将平板计数法作为对照试验进行比较，检测结果参见表1。从表1可以得出两种方法所得的测定结果基本一致，表明构建的检测金葡菌的新方法可以应用于实际样品的检测分析。

表1人工污染实际样品中金黄色葡萄球菌的检测结果

实施例2：目标dna(tdna)的特异性分析

特异性是基于夹心杂交原理建立的，即探针与目标序列之间特异性的互补配对作用。

在磁纳米粒子浓度为1.0mg/ml，捕获探针浓度为100nmol/l，扩增时间为50min，连接时间为50mi的条件下，将等体积等浓度tdna(序列如seqidno:1所示)和碱基错配dna序列(mdna1、mdna2、mdna3和mdna4，与tdna相比，分别为一个碱基错配dna、两个碱基错配dna、三个碱基错配dna、随机序列dna；序列分别如seqidno:6～seqidno:9所示，)作为检测对象，用于评价本实验的特异性。

如图4所示，不同dna序列检测得到不同的相对发光值，从中可看出tdna对应的相对发光值明显高于mdna1、mdna2、mdna3和mdna4。此外，根据图4还可以推断出，碱基错配的数目越多，检测得到的相对发光值越低，其中随机序列mdna4与空白对照结果相近。以上分析结果表明，碱基的错配会影响探针与tdna的互补配对作用，从而影响probe1-mnps捕获tdna以及tdna与probe2的杂交作用，以及rca反应的进行和dna酶的生成，最终使得相对发光值的降低，从而可确保对tdna检测的特异性。故推断，基于序列如seqidno:1所示的tdna构建的检测方法具有较高的特异性。

实施例3：金黄色葡萄球菌的特异性分析

基于核酸探针与金葡菌16srdna特异性互补配对的原理。

使用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌和痢疾志贺氏菌作为待测样品，采用实施例1的方法对检测效果进行了考察和比较，并以te缓冲液为空白对照。

由图5可以看出金葡菌的相对发光值远远高于沙门氏菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌和痢疾志贺氏菌，表明实施例1的方法对金葡菌具有良好的特异性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一种磁分离rca合成dna酶检测金黄色葡萄球菌的方法

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<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

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<213>人工序列

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